抗纤灵冲剂对大鼠体外肾系膜细胞增殖及分泌ECM影响的研究_0.docVIP

抗纤灵冲剂对大鼠体外肾系膜细胞增殖及分泌ECM影响的研究 【关键词】 细胞增殖 　　我们以前的 研究 证明，中医抗纤灵冲剂对慢性肾功能衰竭（CRF）［1］患者及实验性慢性CRF大鼠肾脏功能和结构损害有明显的改善作用［2］，但作用机制尚不清楚，近年来研究表明，肾系膜细胞（MC）、细胞外基质（ECM）及各种细胞因子、生长因子在肾功能进行性减退过程中起着重要作用［3］。本研究采用血清药 理学 方法 和MC体外培养技术，观察了抗纤灵冲剂对大鼠肾系膜细胞增殖和ECM的主要成分纤维联结蛋白（FN）、型胶原（C-）的 影响 ，并与西医血管紧张素转换酶抑制剂蒙诺做对照，以期从细胞水平探讨抗纤灵冲剂防治CRF的作用机制， 发展 中医药防治CRF的 理论 认识，为进一步提高CRF的中医药诊治水平提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 抗纤灵冲剂（KXL）由丹参、大黄、牛膝、桃仁、当归组成，由上海中医药大学附属曙光 医院 提供，每袋含生药9g；肾组织来源为上海必凯实验动物中心提供的SD大鼠的肾组织，体重为（150±20）g，大鼠肾小球系膜细胞株由长征医院肾科提供（第54代）。对照西药为血管紧张素转换酶抑制剂蒙诺（福辛普利），每粒10mg，由上海中美施贵宝公司提供。定量测定人血清型胶原试剂盒，由中美合资上海华泰生物工程有限公司提供。FM免疫比浊法定量试剂盒：由上海玉兰生物技术研究所提供。培养条件：37、5%CO2。RPMI-1640培养基为美国GIBCO产品。胎牛血清（FCS）由上海第二医科大学提供，56水浴30min灭活分装，于-20冰箱保存备用。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 动物分组 SD雄性大鼠56只，每组8只，用Platt法5/6肾切除做大鼠慢性肾衰模型，分两期完成，先背部切口切除左肾2/3，1周后切除整个右肾。假手术组仅背部切口分两次剥离左右肾包膜，保留肾上腺，根据手术后2周所测血肌酐值分组，造模组及 治疗 组大鼠经统计学处理，使分组后各组血肌酐、尿素氮值无明显差异。分为7组，假手术组（A）；假手术加抗纤灵组（B）；模型组（C）；西药蒙诺对照组（D）；抗纤灵组（E）、丹参组（F）、大黄组（G），A、C组用自来水灌胃3ml/d，B、D、E、F、G组按成人常规用量的20倍给药，3ml/d灌胃，实验共进行30天，在最后一次灌胃2h后腹腔静脉无菌采血6ml，分离血清，56水浴30min灭活后分装，于-20冰箱保存备用。 　　1.2.2 体外培养的大鼠肾系膜细胞（MC）的方法 将从液氮中取出的冻存MC按细胞复苏法复苏，传代3次，按MC传代法经胰蛋白酶消化后收集于胰心管内用含20%FCS的1640培养液配成3×104ml细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μl，培养箱中孵育24h后弃去培养液，换1640液继续培养24h，使大部分细胞静止于G期，弃去培养液，然后8孔1组，分别加入含A~G组10%和20%血清的1640培养液（由于条件原因10%B组5孔，20%B组6孔），继续培养72h后，每孔加入噻唑蓝（MTT）溶液（5mg/ml）10μl，37继续孵育4h终止培养，弃去培养液72h后，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μl，振荡10min。于酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值（选择波长492nm）。 　　1.2.3 测定大鼠肾系膜细胞分泌细胞外基质、纤联蛋白、型胶原的方法 将复苏后传代3次的MC按传代法经胰蛋白酶消化后收集于离心管内，用含20%FCS的1640培养液配成6×104ml悬液转种至24孔板，每孔500μl，继续培养24h，弃去上清，每孔加入含0.5%FCS的1640培养液500μl，继续培养24h，使细胞生长同步。弃去上清，含10%、20%血清的1640培养液A组各5孔，B组各7孔，C组各5孔，D、E组各10%7孔、20%8孔，每孔500μl。培养72h后弃去上清，加入含0.5%FCS的培养液每孔1ml，培养24h，吸取上清，测定纤联蛋白、型胶原含量。 　　2 结果 　　2.1 抗纤灵方对MC增殖的影响 与A组比较差异有显著性（P＜0.05），说明肾衰血清能明显刺激系膜细胞增殖。与C组比较差异有显著性（P＜0.05），说明抗纤灵方及其组方单味药丹参、制大黄能减轻肾衰血清对系膜细胞的刺激，明显抑制系膜细胞增殖，并呈浓度依赖性。蒙诺与抗纤灵作用相似。见表1。 　　表1 抗纤灵对离体大鼠系膜细胞的增殖的影响 （略） 　　2.2 抗纤灵对大鼠肾系膜细胞分泌细胞外基质的影响 见表2。 　　表2 抗纤灵对大鼠肾系膜细胞分泌细胞外基质的影响 （略） 表2中数据说明肾衰大鼠血清能刺激肾系膜细胞分泌型胶原、纤联蛋白，而且与浓度呈正比。提示肾衰大鼠血清对肾系膜细胞分泌型胶原的刺激作用有随浓度的增高而增高的趋势；而假手术大鼠含药血清组（