松果体褪黑素对大鼠下丘脑CRH神经元的影响.docVIP

松果体褪黑素对大鼠下丘脑CRH神经元的影响 【摘要】 　　目的 研究松果体和褪黑素对大鼠下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）神经元形态和功能的影响以及补充褪黑素的作用。 方法 雄性清洁级SD大鼠100只，随机分为对照组、假手术对照组、松果体摘除组、松果体摘除+褪黑素腹腔注射7.5 mg/kg组和松果体摘除+褪黑素腹腔注射15 mg/kg组，采用原位杂交和免疫组织化学方法来检测松果体摘除及补充褪黑素后下丘脑CRH神经元的变化。 结果 松果体摘除后大鼠下丘脑室旁核CRH表达增强。松果体摘除大鼠补充褪黑素后，CRH神经元表达增强呈剂量依赖性恢复，但不能恢复至正常。 结论 松果体摘除导致大鼠下丘脑室旁核CRH神经元合成CRH增加，补充外源性褪黑素后能在一定程度上逆转上述异常。松果体可能是神经内分泌免疫 网络 的结构和功能的重要稳定因素之一。 【关键词】 松果腺； 褪黑激素； 下丘脑室旁核； 神经元； 原位杂交； 免疫组织化学 　　近年来不少研究发现松果体褪黑素对下丘脑垂体肾上腺轴（hypothalamicpituitaryadrenal，HPA）有明显的调节作用[16]，而该轴分泌的糖皮质激素对机体的免疫功能具有明显的抑制作用，因此很多学者认为松果体褪黑素通过调节HPA轴进而调节免疫功能是其实现免疫调节的一个重要途径。松果体对垂体和肾上腺影响的研究已较为深入，体内、外实验无论从形态和功能方面都证明松果体褪黑素对HPA有调节作用[38]，但迄今为止松果体对下丘脑影响的研究主要停留在松果体褪黑素对下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)神经元分泌的CRH的影响的水平上。笔者研究是为进一步揭示松果体及褪黑素对免疫功能以及免疫相关性疾病如肿瘤、自身免疫性疾病等的影响机制提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 分组 选用2月龄雄性清洁级SD大鼠100只（浙江省实验动物中心，合格证书号：2001001），体质量(200±10）g。标准颗粒饲料，自由摄食饮水， 自然 光照。随机分为对照组（N组）、假手术对照组（Sham组）、松果体摘除组（M0组）、松果体摘除+褪黑素腹腔注射7.5 mg/kg组（M1组）和松果体摘除+褪黑素腹腔注射15 mg/kg组（M2组），注射时间为每天1700，注射后4，8周取材，M0组动物腹腔注射等量生理盐水。 　　1.1.2 主要试剂及仪器 褪黑素（美国Sigma公司），羊抗CRH多克隆抗体、羊ABC染色系统（美国Santa Cruz Biotechnology公司），大鼠CRH原位杂交试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），大鼠血清CRH ELISA试剂盒（美国ADR公司）。牙科涡轮高速牙床（cs181，上海齿科医械厂），手摇切片机（1712，德国LEica公司），光学显微镜（BH2,日本Olympus公司），酶标检测仪（550,美国BioRad公司），数字显微摄像系统（日本Nikon公司），图像分析系统（JD801，南京捷达公司）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 动物模型建立及取材选片 根据 文献 [9]，2%戊巴比妥钠麻醉（45 mg/kg）后，用牙科涡轮高速牙床，以人字缝为中心五边型磨开颅顶诸骨后摘除松果体。Sham组动物除不摘除松果体外，其余步骤同M0组。于术后4周和8周取全脑，10%甲醛固定，常规石蜡包埋，取材器械及配溶液所用的双蒸水均用DEPC处理，由于CRH神经元主要分布在下丘脑室旁核（paraventricular nucleus，PVN）后部的小细胞群[10]，故自前连合至乳头体前缘（下丘脑所在范围）行冠状面连续切片，片厚10 μm，每隔10片取1片按前后顺序用APES粘片并做苏木素伊红（HE）染色，镜下观察选出所有室旁核后部平面的切片。 　　1.2.2 下丘脑CRH原位杂交 随机选取每只动物室旁核后部3张切片行原位杂交检测CRH mRNA，杂交过程参见试剂盒说明。主要步骤为：3%H2O2 10 min，3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶10 min,PBS洗后入预杂交液40 3 h,入杂交液（含CRH寡核苷酸探针）40 过夜，SSC洗涤后加封闭液37 30 min,入生物素化鼠抗地高辛37 1 h，PBS洗后入SABC 37 20 min，PBS洗后加生物素化过氧化物酶37 20 min，PBS洗后DAB显色5 min,常规脱水透明封固。以预杂交液代替杂交液作为阴性对照。 　　1.2.3 下丘脑CRH免疫组织化学染色 随机选取每只动物室旁核后部3张切片行ABC法检测CRH，染色过程参见试剂盒说明。主要步骤为：微波修复15 min（修复液为柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0），PBS水