2011酶工程 第二章 酶的分离纯化.ppt

酶工程 第二章 酶的分离纯化 　概 述　 酶分离的意义 （１）理论意义 　　研究酶结构功能，动力学特征的需要． （２）生产意义 　　医药用酶，工业生产用酶需要较高纯度．通常分离纯化成本占总成本60%-70%左右 　酶分离的基本过程 　酶分离需要注意的事项和原则 （1)切记酶是蛋白质，防止酶失活变性 a. 温度 低温 b. pH 一般中性 pH4, 10不稳定, 局部酸、碱过高 c. 剪切力 蛋白变性（操作时形起泡沫） d. 重金属， 有机溶剂 f. 微生物及蛋白酶污染 （２)工艺采用的分离处理手段要按目标酶和杂质 　分离蛋白也要求知己（分离的目标酶的性质）知彼（杂蛋白或其它分子的性质），再根据目标酶和杂质的性质差异选用合适的分离处理手段． 　　蛋白可以用于分离的性质有： 分子大小，溶解度，电性，吸附性，亲和性，稳定性 1）溶解度： 盐析 有机溶剂沉淀法 选择性沉淀法 共沉淀法 PEG沉淀法、 等电点沉淀法 2）分子大小差异：胶过滤 超滤 离心 超离心 3)?吸附特性差异：吸附 疏水层析 高压层析(HPLC) 4) 电荷性能不同: 离子交换 电泳（区带、等电聚焦） 聚焦层析 ? （３）工艺安排按先粗分后精分的原则 　设计工艺时先采取处理量大，分辨率低的工艺（如沉淀，萃取）工艺，后采取处理量小，分辨率高的工艺（如层析，电泳）手段，如果反过来，增加后处理负荷，而且会使分辨率高的工艺分离变差（如层析加样过大，色谱峰会扩散，导致分离效果变差） （４）踪酶分离每一步的总活力和比活力 评价每步分离操作的效果 纯化后总活力＝单位活性×体积 比活＝活力÷蛋白量 回收率＝纯化后总活力÷纯化前总活力×100% 纯化倍数=纯化后比活÷纯化前比活 还可节约成本（在纯度很高的产品无须继续采用分离手段，从而节约成本） 第一节　细胞破碎 　 一 机械破碎方法 （1）高速组织捣碎机 原理：利用旋转叶片的剪切力量 操作：装料，低速→高速，注意要间歇操作（电机过热） 效果：作用强烈，活性物质易受破坏 （2）匀浆器 原理：利用原料与杆和套筒之间摩擦及剪切力 操作：把原料做成糊状，放入杆和套筒间隙中 效果：破碎程度较捣碎机高，破坏较少 （3）研磨器 原理：利用原料与石英砂或研钵壁之间摩擦及剪切力 操作：把原料做成糊状，放入石英砂 效果：手工操作，破碎程度相对低 二 物理破碎 温度差破碎法（冻融法） 压力差破碎法（渗透压） 超声波破碎法 原理：空穴效应产生的机械剪切力及热效应 影响因素：样品浓度、超声波频率、功率、破碎时间（超声水浴通常只20kHz,300w左右，工作时间比如下带超声探头的长） 操作：冰浴（用烧杯装冰块）、间歇进行（一般工作1分钟，间歇1分钟） 三 化学破碎法 四 酶学破碎法 外加酶制剂或自溶法 生物酶(如溶菌酶)有降解细菌细胞壁的功能。在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。 而在破坏酵母菌的细胞时，可采用蜗牛酶进行。一般对数期的酵母细胞对该酶较敏感。将酵母细胞悬于 酶促破碎 革兰氏阳性菌（肽多糖）--溶菌酶 酵母细胞（b1-3葡聚糖）--葡聚糖酶 霉菌（几丁质） --几丁质酶 植物细胞（纤维素） --纤维素酶等 第二节 提取 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。（热力学） 酶都能溶解于水，通常可用水或稀