新人教版选修1：52《多聚酶链式反应扩增DNA片段》课件.pptVIP

2 、过程 ①稀释 2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释 ②对照调零 以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零 取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值 ③比色 比色杯 ④计算 DNA含量（ ?g ）＝50 x (260nm的读数）x 稀释倍数 50：1 ?g /ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02 四、 课题延伸 例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝） PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出特点 专题5 DNA和蛋白质技术 课题目标 1、了解PCR技术的基本原理； 2、尝试用PCR技术扩增DNA片段; 课题重点、难点 重点：PCR的基本原理和PCR的基本操作； 难点：PCR的基本原理; 课题背景 1、多聚酶链式反应(PCR):是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝； 2、意义：解决了样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题； 3、应用：广泛的应用于疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等问题； 4、目标： （1）了解PCR的基本原理； （2）尝试用PCR技术扩增DNA片段； 一、基础知识 （一）、PCR原理 1、DNA分子的双螺旋结构 （1） DNA分子是由两条反向平行的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’ －3’ ）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构； （2）脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧； （3）两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：A与T，C与G配对，称为碱基互补配对原则。 2、细胞内参与DNA复制的各种组分与反应条件 （1）模板： DNA母链 （2）原材料： 4种脱氧核苷酸 （3）酶： 解旋酶：使得DNA双链打开 DNA聚合酶：催化DNA子链的合成 （4）能量： ATP （5）引物： 是一小段DNA或RNA，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 3、DNA的复制过程 ① DNA的解旋 亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链 ② RNA引物的合成 以单链DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段RNA引物 ③ DNA的生成 以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在DNA或RNA引物的3’末端开始连接脱氧核苷酸，形成由5’端－3’端的DNA合成方向。 ④切掉引物生成冈崎片断 在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下将引物部位换上DNA，此时的DNA片断称为冈崎片断 ⑤ DNA片断的连接 在DNA连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形成一条完整的新的DNA链。新链与旧链构成新的DNA。 4、 3’端与5’端及DNA合成方向 （1）DNA双链的方向： 反向平行的双螺旋结构 （2） 3’端与5’端： ①、3’端：连接在3’碳原子上的-OH末端； ②、5’端：连接在5’碳原子上的磷酸基团末端； （3） DNA复制的方向： ①、 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA子链； ②、当引物与模板链结合时产生一个子链的3’末端，形成一个由5’端到3’端的延续方向，并催化延伸； 5、 PCR的基本原理与Taq酶、缓冲液等条件 （1） PCR的基本原理：DNA的变性与复性 ①、DNA的变性：在80—100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构解体，双链打开称为变性； ②、DNA的复性：变性后的DNA，当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链重新恢复双链结构 ； PCR利用了DNA的热变性原理，通过温度控制来控制双链的解旋与结合，现在使用的PCR仪，实质上也是一台自动温控仪器。 高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，在解决这个问题前PCR并非一种实用的实验方法。 （2） Taq DNA聚合酶的应用 ①、Taq DNA聚合酶的发现和应用：（专题2，课题2) 解决了这一问题 ②、Taq酶特点：耐高温或热稳定性强 ； ③、Taq酶发现的意义：增大了PCR的效率，使PCR趋 向于自动化，最终成为现代生物学实验工作的 基本方法之一 ； （3） 缓冲液：需要为PCR反应提供了适宜的PH和使DNA分子免遭降解。 （4） PCR的条件： （1）模板： 加入模板DNA （2）原材料： 4种脱氧核苷酸 （3）酶： 耐高温的TaqDNA聚合