基因工程技术简要介绍课件.pptVIP

基因工程技术 将外源基因（又称目的基因，是一段 DNA 片断）组合到载体 DNA 分子中去，再把它转到受体细胞（亦称寄主细胞）中去，使外源基因在寄主细胞中增值和表达，从而得到期望的由这个外源基因所编码的蛋白质。 所以，基因工程的操作包含以下步骤： ? 获得目的基因 ? 构造重组 DNA 分子 ? 转化或转染 ? 表达 ? 蛋白质产物的分离纯化 到哪里去找目的基因？  从组织细胞中可以分离得到人/小鼠的全套基因，称为基因文库。文库中基因总数 就人来说约有 3 万个基因。如何从中把需要的基因找出来？采取“钓”的办法。这个办法通常称为印迹法。 印迹法的关键是“分子杂交”，利用碱基配对的原则，用一段小的已知的 DNA 片断去寻找（“钓”）大的未知的基因片断。 探针 DNA 片断从何而来？ 根据目的蛋白的氨基酸序列，只要其中 N－端 15-20 个氨基酸序列，按三联密码转为 40-60 核苷酸序列，人工合成，即为探针 DNA 片断。 （2）目的基因的扩增 （3）PCR——把寻找目的基因和扩增目的基因两步操作并成一步。 PCR 的三个步骤为一次循环，约需5－10 分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过 20 次循环，即可扩增 106 倍，总共只需几个小时。 （4）构造重组 DNA 分子 其次要把目的基因“装”到载体中去。“安装”的过程，需要好几种工具酶，其中关键的酶叫限制性内切酶。 此酶识别一定碱基序列，有的还可切出“粘性”末端，使得目的基因和载体的连接非常容易。 （5）转化/转染—表达—蛋白质分离 重组 DNA 分子进入寄主细胞后，其中的目的基因能否表达，表达效率高低，还有很大差别。表达通常是指目的基因编码的蛋白质合成。基因工程的最后一步，是把所获得的蛋白质分离纯化，得到蛋白质产品。 *  基因工程是生物技术的核心部分。 基因工程的操作可以简述如下： 1、基因工程技术 基因工程的操作流程 （1）获得目的基因 印 迹 法 内切酶切开DNA 电泳 印迹转移 放射性探针 杂交 胶片显影 印迹法的主要步骤：（1）基因文库－ DNA 用限制性内切  酶处理。（2）DNA 片断混合物通过电泳分离。（3）电泳后，通过印迹技术转到酯酰  纤维薄膜上，以便操作。（4）用已知小片断DNA 作为探针，  互补结合需要找的基因片断。（5）探针DNA 片断已用放射性元素 标记，使胶片感光后可看出。 用上面的方法“钓”出的目的基因，数量极少，所以，接下来必须经过扩增，亦称为基因克隆。获得相当数量的目的基因后，才能继续下一步操作。 PCR法，又称多聚酶链式反应，是近年来开发出来的基因工程新技术，它的最大优点是把目的基因的寻找和扩增，放在一个步骤里完成。 P C R 操作流程 90 0 C 50 0 C 70 0 C PCR 反应分三步完成：第一步 —— 90 0C 高温下，使混合物的DNA 片断因变性而成单链。第二步 —— 50 0C 温度下，引物 DNA结合在适于配对的DNA片断上。第三步 —— 70 0C 温度下，由合成酶（ DNA 高温聚合酶）催化，从引物开始合成目的基因 DNA。 首先要有载体。载体有好几种，常用的有：质粒－－环状双链小分子DNA，适于做小片断基因的载体。噬菌体DNA－－线状双链DNA，适于做大片断基因的载体。 用质粒 构建重组DNA分子 用噬菌体DNA构建重组DNA分子 限制性内切酶 识别特定的 碱基序列 限制性内切酶造成粘性末端 有利于重组DNA 分子的构建 把构造好的重组 DNA 分子送进寄主细胞，亦需要适当的技术方法。若受体细胞是细菌，通常称转化；若受体细胞是 动/植 物细胞，通常称转染。 * * *