第21章 基因工程(改).ppt

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 第 二 节 重组DNA技术 1、宿主的限制与修饰现象 限制:实际就是限制性核酸内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。 几种不同的末端 ⑴能自主复制； ⑵有遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定 ⑶常具有多个酶的单一酶切位点，称为多克隆位点； ⑷表达型载体应配备与宿主细胞适应的启动子、增强子等。 筛选标记的依据： ①pUC的LacZ基因： β半乳糖苷酶α片段（N末端） ②宿主： β半乳糖苷酶ω 片段（ C末端） ①②同时表达，才有β半乳糖苷酶的活性，使特异的作用物（X-gal）转变为蓝色。 若目的基因插入pUC的LacZ基因： N末端片段无法生成，宿主无β半乳糖苷酶活性 X-gal培养呈白色。 利用α-互补筛选重组体pUC18 其它载体 1） 酵母人工染色体载体（ yeast artificial chromosome YAC）：大容量的载体。 2） 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 3） 病毒改造的载体： 真核重组及其表达载体、基因治疗载体。 DNA病毒：SV40（猴肾病毒）、痘苗病毒。 RNA病毒：反转录病毒、植物病毒。 昆虫病毒：具宿主专一性强特点，能表达原核与真核两类基因。 （一）目的基因的获取 1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应( PCR) 利用α-互补筛选重组体pUC18 pUC18 2686bp β半乳糖苷酶 N端编码序列 启动子 ampr 转化 β半乳糖苷酶 N端编码序列 细菌染色体（ 酶缺陷） pUC18 细菌在含X-gal和Lac操纵子 诱导剂的琼脂上培养 含载体的pUC18 蓝色菌落 裂开的N端 外源DNA 裂开的N端 多克隆位点 ampr pUC18 2686bp 转化 pUC18 细菌在含X-gal和Lac操纵子 诱导剂的琼脂上培养 含重组体的 pUC18白色菌落 3. 粘性质粒(柯斯质粒,cosmid) 质粒+噬菌体。具有二者的双重特性 三、基因工程的操作过程 （四）外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接 （二）克隆载体的选择和构建 （三）限制性核酸内切酶的应用 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 目 录 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 目 录 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 目 录 2. 平端连接 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 　3′ 5′ 　　　　 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 　3′ 5′ 　　　　　5′ 3′ A(A)nA 　A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 3. 同聚物加尾连接 4. 人工接头(linker)连接 受体菌条件 安全宿主菌 ：限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(具备接受外界DNA 能力) 导入方式 转化 ：外源DNA进入原核细胞 转染 ：外源DNA进入真核细胞 感染 ：通常侧重指技术手段 （五）重组 （六）重组体的筛选 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等 * 目 录 * 目 录 * * * 生化教研室 雷 康 福 第 十 四 章 基因 基因工程 基因治疗 分子杂交 转基因技术 基因敲除 基因诊