Real-timePCR及其质量控制.pptVIP

FAM VIC VIC FAM FAM VIC 基因分型检测 Homozygote for FAM-specific allele Homozygote for VIC-specific allele Heterozygote for both alleles 等位基因自动识别软件 ?加速数据分析 ?等位基因分组识别 ?每一个孔的质量评分 ?用户自定义的质量评分 标准 ?基于每一个标记的识别 ?限制用户的主观干扰 阴性阳性鉴定 ?定义：阳性/阴性实验是一种终点分析，它可以确定某个样本中是（阳 性，用加号表示）否（阴性，用减号表示）存在一个特异性目标序列。 在终点分析中，数据是在PCR过程结束时获得的。 ?什么是IPC？IPC是一种阳性内对照，它被用在阳性阴性实验中，用 于监测PCR过程并确定阴性结果不是因为PCR失败而造成。，IPC包 括一个模板、一组引物和一个荧光标记（VIC）的探针，被加到反应 板的每一个孔中。 阴性结果示例 阳性结果示例 microRNA ? MicroRNA(miRNA)是一种 22个碱基左右的内源性单链 小分子RNA ?由带茎环结构的双链RNA前 体剪切而成 ?具有高度保守性、时序性和 组织特异性 ?通过与特异mRNA结合，抑 制目标基因表达或降解 mRNA *mature active strand miRNA Expression 1. Transcription 2. Hairpin release in the nucleus 3. Export to cytoplasm 4. Dicer processing 5. Strand selection by RISC 6. Translational repression Mechanisms of Small RNA-Induced Gene Regulation 为何研究miRNA？ ?miRNA已被确认为一类新的基因调控因子，参 与了细胞的发育、分化和联络 ?对miRNA功能的研究将有助于设计siRNA干扰 实验 ?miRNA有可能成为新的生物分子标记 ?有重要的临床应用价值 Northern Blot (杂交法) ? Homegrown technology and easy to access (易于操作) ? Large sample amount requirement (ug scale) (需大量样品 ? Low dynamic range (two orders of magnitude) (可测范围低) ? Mismatch hybridization often cannot distinguish well between miRNAs that only have small sequence differences (错配杂交问题) Microarrays (芯片法) ? High throughput (高产出) ? Improved dynamic range (可测范围较宽) ? Large sample RNA requirement, approximately 5 μg per array (需大量样 品) ? Difficult or impossible to distinguish between the Pre-miRNA and miRNA (很难区分前体miRNA and 成熟miRNA) ? Do not distinguish well between miRNAs that have only small differences in sequence. (对类似结构的miRNA分辨率差) Quantitative Real-Time PCR (实时定量PCR) ? Dramatically less sample requirement (只需微量样品 ? Significantly wide dynamic range (7 logs) (非常宽的可测范围) ? High sensitivity and specificity (高灵敏度, 高特异性) ? However, how to design a TaqMan real-time PCR assay on a ~22 base polynucleotide fragment? (但是, 如何设计这样一个靶物只有22个碱基 TaqMan real-time