Part-14分子生物学技术.pptVIP

生物工程 biological engineering 遗传工程 genetic engineering 基因工程 gene engineering 分子克隆 molecular cloning 基因克隆 gene cloning 基因操作 gene manipulation 重组DNA技术 recombinant DNA technique 第一节 分子杂交及相关技术 原理： 带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 分子杂交（molecular hybridization）,标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。用于鉴定复杂的靶分子中同源片段。 分子杂交包括：DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。 二、印迹杂交 Southern blot：1975年，英国科学家Southern首创，是指DNA-DNA杂交，是经典的基因分析方法。 Northern blot：是指DNA-RNA分子杂交，应用特异性基因探针分析基因的转录水平。 Western blot：是指抗体-蛋白分子杂交，用于蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。 DNA mobility shift assay： DNA迁移率变动实验，指DNA-蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术，是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。 二、限制和修饰作用的分子机制 1．大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株 ，有各自的限制和修饰系统 2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株/B株中， 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护. 2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。----（修饰） 3．当外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解----（限制） 4. 由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程 中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。 5．但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记(一但 入-K 噬菌体在 B 株成功，由 B 株繁殖出 入-K 后代，能感染 B 株, 不能感染原来 K株.) 6．细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外来DNA。C株不能产生限制性内切酶，其它来源入- 噬菌体可以感染C株，而在C株繁殖入- 噬菌体则在 K株和 B 株 受到严格的限制作用 四、II类限制修饰酶基本特怔 （1） 命名规则： 属名 菌株名 E co R I 种名 编号 （2）能识别和切割的通常4-8 个核苷酸序列，为限制性位 点(restriction sites） （3）切割方式 同位酶; 同裂酶; 同尾酶 粘性末端（sticky end） 和平末端 (blunt end) 第三节 质粒构建 常用的质粒如pUC18，多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色色。从而筛选阳性菌落。 1．质粒： Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。 2、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC） 优点：能携带大片段DNA，约300kb。 在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产DNA。 缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。 为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，E coli中的F因子。此质粒含有2种基因（part A, part B）。每个E coli能接受 300kbDNA片段。 步骤三： 目的基因导入受体细胞 第五节 DNA序列分析 The plasmid pUC18 offers several advantages as a vector for cloning. 利用Lac Z基因的插入失活筛选重组子 许多载体的多克隆位点区插入在Lac Z基因区中。Lac Z基因编码β-半乳糖苷酶的一个亚基，它可以使携带载体的细菌在含有X-gal（能被β-半乳糖苷酶水解的底物）的培养界上形成蓝色的菌落。 当外源基因插入到多克隆位点区后就阻断了Lac Z基因的编码区，使Lac Z基因失去了功能，因此，凡是插入了外源基因的重组质