CH5-gangan-MB核酸杂交、基因芯片技术与.pptVIP

分子杂交及生物芯片技术 Zhang guangxian Ph.D zhangguangxian@gzhtcm.edu.cn QQ:Mobile:参考文献 基本概念 变性/复性： 分子杂交：异源互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交 分子杂交技术：凝胶电泳分离待测DNA、RNA、Pr并转移固定到结合物上，然后与探针/抗体杂交分析 探针(Probe)：已知序列的标记单链DNA片断。用于检测与其互补的核酸序 （待测核酸） 基本概念 Bio-chip（生物芯片） DNA chip/microarray Gene chip/microarray Olionucleotide array cDNA chip Protein chip microRNA chip Lab-on-chip（芯片实验室） 分子杂交技术 生物大分子的印迹杂交技术 分子杂交技术 定义：凝胶电泳分离待测DNA、RNA、Pr并转移固定到结合物上，然后与探针/抗体杂交分析 原理：核酸变复性（序列互补）/抗原-抗体 基本工艺： 凝胶电泳（原位处理） 样品转移及固定 杂交分析（免疫结合分析） 分子杂交技术 1969 ，In situ hybridization（ISH） 1975，Southern，Southern blot: DNA 1977，Alwine，Northern blot：RNA 1979，Towbin，Western blot：Pr 1982，Reinher，Eastern blot：Pr 原位杂交分类 原位杂交（In situ hybridization, ISH）： 菌落原位杂交 (Colony ISH) 组织原位杂交(Tissue ISH)： 胚胎原位杂交(Embryo ISH) ： 斑点/狭缝杂交(Dot/slot blot) ： 分子杂交技术探针 探针基本条件（特点） 带标记物（32p, 35S, 125I, Digoxigenin, FITC） 单链核酸（ssDNA，sscDNA(更常用)） 高特异性（~500bp） 标记物稳定灵敏，检测方便安全 分子杂交技术探针 探针的种类 DNA probe（基因copy数、病原基因诊断） cDNA probe（基因表达等最常用） RNA probe（ISH） Oligonuleotide-probe （25~50bp；基因诊断，SNP分析、测序、点突变检测） 分子杂交技术探针 探针标记物 放射性标记物（ [α-*N]-dNTP ） 32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、125I(60d) 非放射性标记物 半抗原：生物素、地高辛 荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC） 分子杂交技术探针 ?-32P- dNTP结构 分子杂交技术探针 分子杂交技术探针 探针标记 随机引物法 PCR标记法 切口平移法 (DNaseI and DNA聚合酶I) 末端标记法 T4多核苷酸激酶 [γ-32p]-ATP标记DNA/RNA-5′ 末端转移酶 （poly(N*)n） T4 DNA聚合酶/Klenow片断 （粘末端补平） 分子杂交技术探针 探针纯化 乙醇沉淀法 凝胶过滤法 （G-50 Spin column） 分子杂交技术—印迹 印迹（转膜）支持物： 硝酸纤维素膜（NC膜） 尼龙膜 N+-nylon （DNA/RNA） 中性膜 PVDF膜（western blot） 分子杂交技术—印迹 印迹（转膜）方法： 毛细管虹吸转移法 真空转移法 电转移法 分子杂交技术—印迹 毛细管虹吸转移法 分子杂交技术—印迹 电转移法 分子杂交技术—印迹 分子杂交技术—印迹 Western blot (SDS及转膜系统) 分子杂交技术—影响因素 离子强度 温度/时间 有机试剂（去离子甲酰胺） 探针长度/浓度 样品的浓度 洗涤条件 分子杂交技术—基本流程 样品及探针制备 样品电泳分离 转膜 预杂交 杂交 洗膜 分析（压片、显色、荧光观察等） 分子杂交技术 Southern blot DNA提取 酶切 电泳/拍照 转膜/固定 探针制备 预杂交 杂交 洗膜 扫磷屏 分子杂交技术 分子杂交技术 Southern blot 应用 DNA多态性分析（RFLP分析/SNP/SSCP/RAPD） 基因突变检测 基因copy数检测 重组子筛选 DNA指纹分析 测序 分子杂交技术 Southern blot 分子杂交技术 Southern blot 应用 DNA指纹分析 分子杂交技术 Northern blot 基因表达分析 mRNA长度及半定量分析 分子杂交技术 Western blot 蛋白提取/样品准备 SDS电转/丽春红S染色 封