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（C）iPS-TTFgfp4-7和iPS-TTFgfp4-3细胞对裸鼠胚胎发育的贡献。iPS细胞微注射进胚泡，胚经荧光显微镜分析的结果。标尺=200mm(上面)和2mm(下面). 图 5. 从成年小鼠尾尖成纤维细胞诱导的iPS细胞的特征 图 5. 从成年小鼠尾尖成纤维细胞诱导的iPS细胞的特征 心脏 肝脏 皮肤 性腺 神经管 胃肠道 （D）嵌合胚胎切片后被抗绿色荧光抗体（棕色）染色,细胞被伊红（蓝色）所复染。 以上组织学分析证实，iPS细胞有助于所有三个胚层的形成。 这些数据表明，这四个因子可以诱导成年小鼠成纤维细胞培养成多功能干细胞。 图 5. 从成年小鼠尾尖成纤维细胞诱导的iPS细胞的特征 （A）iPS细胞（MEF4-7，MEF10-6，TTFgfp4-3和TTFgfp4-7）、ES细胞和MEFs细胞内四因子和其他蛋白的免疫印迹分析。 免疫印迹分析表明，iPS细胞内四因子的总蛋白含量与胚胎干细胞相当。我们可以在iPS细胞内检测到Nanog和E-ras蛋白，但比胚胎干细胞的水平低。 图 6. iPS细胞的生化和遗传分析 （B）体内体外培养的iPS细胞与未分化胚胎干细胞内Oct3/4、Sox2和Nanog因子的RNA（右）和蛋白质（左）水平的差异。 图 6. iPS细胞的生化和遗传分析 （C）Southern杂交分析显示了外源基因的整合。从iPS细胞与胚胎干细胞分离到的基因组DNA被EcoRI和BamHI消化，经琼脂糖凝胶分离，转移至尼龙膜，与Klf4 cDNA探针杂交。 图 6. iPS细胞的生化和遗传分析 （D）Southern杂交分析显示iPS-TTFgfp4-2克隆核型正常。iPS-TTFgfp4（克隆1，2，3，7，11）和IPS-TTFgfp4wt（克隆1-3）的核型分析表明，2个iPS-TTFgfp4克隆和所有iPS-TTFgfp4wt克隆显示正常的40XX核型。 图 6. iPS细胞的生化和遗传分析 （E）不添加饲养细胞培养得到的iPS细胞和胚胎干细胞的形态。加或不加LIF(白血病抑制因子)对照，在明胶涂层6孔板培养5天后培养得到1000细胞。标尺=200毫米。 LIF/STAT3控制胚胎干细胞的自我更新和多能性。 图 6. iPS细胞的生化和遗传分析 Oct3/4、Sox2和Nanog在维持多能性中表现出核心转录因子的功能。我们发现三者中，Oct3/4、SOX2是iPS细胞生成的关键。令人惊讶的是，Nanog不是必需的。另外，我们确定了c-Myc和Klf4也是重要因子。这两个肿瘤相关因子不能被其他癌基因所取代（图2A）。 讨 论 鼠胚胎细胞与成人成纤维细胞通过特定因子培养诱导成多功能干细胞 C-Myc蛋白有许多促进增殖和转化的下游目标，其中可能有些在iPS细胞的诱导中发挥作用。值得注意的是， C-Myc蛋白与组蛋白乙酰转移酶复合体联合，在哺乳动物的基因组，c-Myc的结合位点可能有多达25000个，比Oct3/4、SOX2的预期结合位点多许多。c-Myc蛋白可能会引起普遍的组蛋白乙酰化，从而允许Oct3/4和SOX2的绑定到特异靶位点。 Klf4已经被发现可以直接抑制P53蛋白的活性，而p53蛋白可以在ES细胞分化过程中抑制Nanog因子。我们发现，iPS细胞内p53蛋白表达水平比MEFs内的低（图6A）。因此，Klf4可能通过抑制P53而有助于Nanog和其他的ES细胞特定基因的激活。或者，Klf4可能通过抑制p53而发挥myc基因诱导的细胞凋亡抑制子的功能。 关于iPS细胞的来源仍旧是值得关注的问题。通过我们的逆转录病毒表达系统，我们估计只有一小部分表达4个因子的细胞变成iPS细胞。低效率表明，并存于成纤维细胞培养中的罕见的组织干细胞，可能诱导成iPS细胞。事实上，多能干细胞已经从皮肤中分离出来。有研究表明，0.067％的老鼠皮肤细胞是干细胞。 一个iPS细胞来源的解释是，由组织干细胞经四个因子转化而得到。然而，我们发现，即使诱导含有丰富间质干细胞和其他多功能细胞的骨髓基质得到iPS细胞的效率也是相当的、极低的。这也不符合组织干细胞是iPS细胞来源的假设。 iPS细胞诱导的低效还有其他的可能，首先，iPS细胞成功诱导所需的4个因子的水平比较严格，只有一小部分4因子表达水平适当的细胞才能诱导成功。有实验证明，Oct3/4因子量50%的增加或减少都会导致ES细胞有差异（已报道）,这也符合我们的假设。 iPS克隆4因子RNA水平分析表明过表达，然而蛋白质水平却与ES细胞相当（图6A、6B），表明iPS克隆存在一个严格调节4因子蛋白水平的机制。我们猜测，高水平的4因子含量在iPS细胞生