FACSCanto流式细胞仪原理与应用范围.pptVIP

FACSCanto II流式细胞仪原理 BD公司介绍 BD公司是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于1897年在纽约创立的,总部位于美国新泽西州 BD公司介绍 位居财富周刊500强的大型跨国公司 产品涵盖诸多医疗领域 生物科学部:流式细胞仪及应用于生物科学的试剂、耗材 BD公司流式细胞仪产品 FACS Vantage SE-大型分选机 BD公司流式细胞仪产品 BD 公司流式细胞仪产品 BD FACSCanto II流式细胞仪 什么是流式细胞仪？ 在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器； 流式细胞仪可告诉我们一个细胞的什么指标? 细胞的相对大小（前向角散射光信号，FSC） 细胞的相对颗粒性及内部结构的复杂性（侧向散射光信号，SSC） 相关的荧光强度 散射光信号的特征 FSC和SSC 当颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为侧向角散色光信号（SSC）。 488nm激光激发产生散射光 散射光信号的特征 红细胞裂解的全血 荧光信号的特征 什么是荧光信号 当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到高能级，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。这种发射出的光称为荧光。 荧光信号的特征 发射光的荧光强度与结合的位点成正比 信号产生 荧光信号 荧光信号的特征 常见荧光染料的发射波长 直方图显示荧光信号 点图显示荧光信号 FACSCanto简介 配置空冷激光 两根激光:488nm、633nm、 光路固定，无需调校 液流系统 信号检测系统 八角形和三角形光学收集系统，将光信号转换成电信号 电子系统将电信号转换成数字化信号 FACSCanto流式细胞仪组成 液流系统 运送样品管中的细胞有序单列通过流动室的感应区，被激光激发，细胞分别被检测，最后进入废液桶。 信号检测系统 产生并收集光学信号 将光信号转变成电信号 电子系统 将电信号数字化，输入计算机并分析 液流系统 流动室 鞘液 酸碱平衡的电解液，可选PBS、血球稀释液或蒸馏水。 样本流 单细胞悬液，浓度5?105?1 ?106/mL 液流系统-样本流速 样本流速的选择 高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低. 低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如DNA分析。 信号采集系统 激光 488nm，633nm，405nm 激发样本中的颗粒或细胞产生散射光信号和荧光信号 信号检测组件-八角形和三角形 光学滤片 将激光激发后产生的散射光信号和荧光信号引导至相应的PMT PMT-将光信号转换成电信号 常用荧光染料的特性 常用荧光染料(488nm,633nm激发) Fluorescein Isothiocyanate (FITC) 异硫氰酸荧光素 Phycoerythrin (PE) 藻红素 Allophycocyanin (APC) 异藻蓝蛋白 Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP) 多甲藻黄素-叶绿素蛋白 Tandem Dyes PE-Texas Red (ECD) PE-Cy5 (PC5) PE-Cy5.5 (PC5.5) (futures) PE-Cy7 (PC7) (futures) FACSCanto信号检测组件 种类 八角形 三角形 构成 检测器 滤片 FACSCanto信号检测组件 八角形检测组件 FACSCanto信号检测组件 三角形检测组件 FACSCanto信号检测组件 检测器 鞘液流中的颗粒通过激光束时会产生光信号，光信号到达检测器生成电脉冲信号，电子系统对电脉冲信号进一步处理。 FACSCanto 两类检测器 光电二极管：FSC 光电倍增管PMT：SSC和荧光信号 FACSCanto信号检测组件 光学滤片用于调整光谱的分布。 当光子遇到滤片时，光子或通过滤片，或被滤片吸收，或被滤片反射。 FACSCanto的滤片 长通滤片（LP）：长于设定波长的光通过，并反射短于设定波长的光 FACSCanto的滤片 带通滤片：允许一定带宽波长的光通过。 FACSCanto的滤片 FACSCanto电子系统 将与电脉冲信号 强弱相关的电压 数字化 有三类电脉冲信号 高度信号H 面积信号A 宽度信号W 几个概念 信号放大 PMT将光信号转换成电信号，调整PMT的电压，信号强度将随之改变。 阈值 信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。 几个概念 颜色补偿 采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时，都需要作颜色补偿。 颜色