DNA重组和基因工程基础.pptVIP

* * * * * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University Ⅱ型限制性核酸内切酶基本特性: 特异的识别4~8个核苷酸组成的识别序列, 识别序列呈回文结构:两个顺序相同的拷贝在 DNA链上呈反向排列 5 ’-G AATTC-3 ’ 3 ’-CTTAA G-5 ’ EcoRⅠ * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 1.产生5′突出粘性末端(sticky end) EcoR I **********GAATTC******** **********CTTAAG******** 5′ 3′ 5′ 3′ *********G *********C T T A A 5′ 3′ 3′ 5′ —OH — P A A T T C********* G********* 5′ 3′ 3′ 5′ P OH— 经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型: * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 2.产生3′突出粘性末端 Pst I **********CTGCAG************** **********GACGTC************** 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ —OH — P *********C T G C A *********G 5′ 3′ 3′ 5′ OH— — P A C G T C*********** G*********** * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 3.产生平末端(blunt end) Alu I *************AGCT************* *************TCGA************* 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ —OH — P *************AG *************TC 5′ 3′ 3′ 5′ OH— — P CT************* GA************* * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 限制性内切酶用途: 基因重组过程中切割DNA以获取目的基 因片段,切割载体形成切口,使目的基因能插入载体中. 2.限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphysms, RFLP)分析:遗传病的诊断,法医 DNA指纹分析等. 3.构建DNA的物理图谱,基因定位,DNA的 同源性分析等等. * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 二 DNA连接酶 DNA连接酶(Ligase)是一种能够催化在双链DNA链的3′-OH和5′-P之间形成磷酸二酯键的酶,可连接互补粘性末端或平端以及缺口修复,不能连接单链DNA或裂口 常用的是T4 DNA连接酶：来源－噬菌体T4感染Ecoli * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 三 逆转录酶 以RNA为模板,逆转录成cDNA第一链,又称依赖 RNA的DNA聚合酶.(AMV最常用) 聚合酶活性:RNA或DNA为模板 3’外切酶活性:能降解DNA-RNA杂合链中的RNA 应用: 1.RT-PCR 使mRNA逆转录成cDNA 2.制备探针 商品化逆转录酶有两种： ①AMV(禽成髓细胞瘤) ②Mc-MLV(鼠白血病病毒). * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 第五节 目的基因和载体连接、转化、筛选 一 外源基因与载体的连接 粘性末端连接 方式:(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAG