NSFC申请报告---韩苏夏.pptVIP

本课题的研究是探寻有效的、安全的和特异的治疗恶性肿瘤的生物学方法。我们选用了鸡贫血病毒的VP3,Apoptin蛋白作为治疗肿瘤的特异分子,使用重组慢病毒技术来增强目的基因在实体瘤内的转导能力,使用信号肽和引导肽序列来实现非肿瘤细胞转导后的长期持续分泌表达.采用Ant-Apoptin和TAT-Apoptin融合表达方式, 保证治疗分子可以进入未转导重组病毒的残余肿瘤细胞和已经转移的肿瘤细胞,并确保治疗分子导入肿瘤细胞核内的靶部位。通过以上设计来实现对肝癌等实体瘤安全有效的特异性治疗。 立 项 依 据 国内外研究现状及发展动态分析 注意事项 层层展开、强调分析综合；着重找出别人研究的不足或缺陷 综述不全面，忽略了重要进展，提出的问题别人已解决 围绕课题的思路进行综述，层次清晰，观点鲜明 逻辑思路不清晰，没有围绕一个中心问题进行综述 研究现状和分析准确客观 论述既要充分又要简练 简单移植或夸大，可行性差 文献类别要全：以国外文献为主，也要引用国内同行知名专家的文献；引文信息要全；文献年代要新：主要是近五年的文献，最好能有申报当年的最新文献。 撰写模式 作者姓名、题目、具体出处(包括期刊名、年份、卷期、页码等)，20～30条；新，精，准！ 注意事项 正文中重要的论点均要有文献标注 引文信息，格式规范统一，与正文相对应 尽可能引用最新的英文文献（近三年占到2/3左右）和顶级期刊文献 常见问题：过于陈旧；参考文献不够全面；格式不统一 立 项 依 据 研 究 目 标 研究目标撰写要点 指研究要达到的目的（最终结果），是对标题进一步的具体化，是研究对象、研究方法、成果和应用的高度概括。 不能够转写成为研究内容中阶段性成果的罗列。 通常使用一、两句话表达清楚。 一般撰写格式 明确……关系，揭示……规律，阐明……原理（机制），建立……方法等。探寻一种治疗肝癌等实体瘤安全的、有效的、特异的生物学方法, 为实体瘤的基因治疗带来新突破 研 究 目 标 研 究 内 容 研究内容是指围绕研究目标拟开展的实验研究。内容要适当：确保研究周期内完成；为目标服务：与研究目标相辅相成；要重点阐述：注意与技术路线区别 。 撰写要求 围绕研究目标逐次展开 研究内容层次分明 研究方法恰当，可操作性强，具有可行性 注意事项内容要适当，确保研究周期内完成 内容要适当，确保研究周期内完成 内容过多，研究周期难以完成 为目标服务，阐述重点 内容分散，不能集中阐明研究目标；与研究方案混淆，罗列实验步骤 问题准确，方法科学、先进 克隆CAV VP3的基因克隆：从患病鸡的外周血淋巴细胞内分离DNA, 使用PCR方法建立CAV VP3/apoptin克隆,测序证实(已完成)。 构建具有信号肽-引导肽-TAT(Ant)-apoptin表达盒：在已经构建的NT4信号肽-引导肽-ADNF重组载体中使用酶切获取NT4信号肽-引导肽-cDNA片段,合成TAT(Ant)渗透肽cDNA片段,通过Hind III同apoptin基因连接构建TAT(Ant)-appotin融合基因片段,通过常规分子生物方法构建NT4信号肽-引导肽- TAT(Ant)-apoptin表达盒。 构建表达TAT(Ant)-apoptin的重组慢病毒：使用常规分子生物学方法将NT4信号肽-引导肽- TAT(Ant)-apoptin表达盒插入到慢病毒重组载体pLenti6/V5-D-TOPO载体中,同pLp/VSVG和pLP1和pLP2四质粒共转染293细胞, Blasticidin筛查阳性转化克隆,增殖后收获表达目的基因的重组病毒。 构建表达TAT(Ant)-EGFP报告基因的重组慢病毒：使用常规分子生物学方法将NT4信号肽-引导肽- TAT(Ant)-EGFP表达盒插入到慢病毒重组载体pLenti6/V5-D-TOPO载体中,同pLp/VSVG和pLP1和pLP2四质粒共转染293细胞, Blasticidin筛查阳性转化克隆,增殖后收获表达报告基因的重组病毒。 表达TAT(Ant)-apoptin的重组慢病毒对肝癌细胞的体外治疗作用：培养P53缺失,P53变异和具有野生性P53的肝癌细胞,感染表达TAT(Ant)-apoptin的重组慢病毒和 表达TAT(Ant)-EGFP报告基因的重组慢病毒,观察转导效率和使肿瘤凋亡能力。 表达TAT(Ant)-apoptin的重组慢病毒对裸鼠移植瘤和转移肿瘤的治疗作用：接种肝癌细胞到裸鼠皮下,制备移植瘤和移植后转移瘤动物模型,肿瘤注射表达TAT(Ant)-apoptin的重组慢病毒,通过病理学检测观察对肿瘤治疗作用和对转移病灶的治疗作用。 表达TAT(Ant)-apoptin的重组慢病毒诱导肿瘤凋亡