RNA干扰技术平台的建立及作用.pptVIP

利用RNAi技术研究14-3-3、STRAD蛋白对LKB1-AMPK能量代谢通路调控作用的研究 目录： 一、本课题相关研究 二、RNAi原理简介 三、RNAi详细步骤 一、本课题相关研究 本课题拟利用RNA干扰技术和western blot等方法探讨LKB1、14-3-3、STRAD三者之间的关系和14-3-3通过能量代谢途径对细胞生长、自噬与凋亡的调控作用，为合理使用抗癌药物、减少细胞耐药性提供理论基础。 二、RNAi原理简介 1、概念 一些小的双链RNA(siRNA)可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNAi）。 RNAi的发现具有划时代的意义，它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程；此外， siRNA本身还是一种极具前景的基因靶向药物，可广泛地用于诸如癌症等疾病的治疗。鉴于siRNA技术的巨大意义与广阔应用前景，2002年美国《科学》杂志将其评为全球年度十大科学进展之首。 2、RNAi转染方式 （1）瞬时转染： 外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。 （2）稳定转染： 外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 3、RNAi具有的特征 ①RNAi是转录后水平的基因沉默机制； ②RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA； ③RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的； ④RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点； ⑤dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡； ⑥ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。 三、RNAi详细步骤 一、总技术线路图 二、干扰靶序列的设计 三、dsDNA的设计与合成 四、感受态细菌的制备 五、质粒实验 六、细胞实验 七检测及结果统计 一、技术线路图 二、干扰靶序列的设计 1、靶序列筛选原则 ① 热力学性质：热力学性质不稳定的序列被剔除； ② 从mRNA的起始序列寻找“AA”二连序列，并记下其3’端的 19个碱基序列； ③ 靶序列长度：设置每个序列的长度为19—21个碱基； ④ 靶序列GC含量：设置GC含量在35—55%； ⑤ 重复序列：剔除串联重复序列； ⑥ BLAST搜索：每个候选序列经BLAST搜索，确保与除目 的基因以外的其他基因mRNA序列同源性小于15bp。 2、利用在线siRNA设计工具进行靶序列的设计 3、分别在基因编码区的上游和下游选择3个靶 序列； 4、通过在线siRNA设计工具，选择评分最高的 3个干扰序列作为靶序列； 5、同时设计一个与人已知基因编码序列无同 源性的无关序列作为阴性对照。 6、本实验设计靶序列 （1）LKB1靶序列 ① 通过在线 siRNA 设计工具，选择评分最高的 3 个干扰序列作为靶序列： 296-TTCAACTACTGAGGAGGTT-314 327-TGTCATCCAGCTGGTGGAT-345 1001-GCATGACTGTGGTGCCGTA-1019 ② 设计一条无关序列作为阴性对照： GACTTCATAAGGCGCATGC （2）14-3-3zeta 靶序列 ① 通过在线 siRNA 设计工具，选择评分