与植物载体表达的重组-李静-.pptVIP

Ti质粒的改造： （1）除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，制成卸甲的Ti质粒，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物； （2）除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长； （3）除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度; 安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列； （4）安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作； 改造后符合的要求： （1）保留T—DNA的转移功能。 （2）取消T—DNA的致瘤性，使之进入植物细胞后不至于干扰细胞的正常生长和分化，转化体可再生植株。 （3）通过简便的手段可使外源DNA插入T—DNA中，并随着T—DNA整合到植物染色体上。 * Free template from 根据中间载体开转化发出两类载体系统： ㈠ 一元载体系统（共整合载体系统） ㈡ 双元载体系统 * Free template from ㈠ 一元载体系统（共整合载体系统） 由中间表达载体与改造后的受体Ti质粒组成。在农杆菌内通过同源重组将外源基因整合到修饰过的T—DNA上，形成可穿梭的载体，在Vir基因产物作用下完成目的基因向植物细胞的转移和整合。 受体Ti卸甲载体及中间表达载体的构建 中间表达载体导入农杆菌 中间表达载体与受体Ti质粒的同源重组 共整合载体的选择 中间载体含有与PGV3850同源序列，单交换形成共整合质粒 Str链霉素抗性基因 Ampr氨苄青霉素抗性基因 由大肠杆菌质粒衍生而来的中间表达载体，均表现为表达缺陷型，不能自主转移，只在具有接合转移功能的协助质粒的存在下才能被动的完成转移。根据中间载体是否有ｒｅｃＡ依赖性重组和协助质粒本身是否转移，可将中间载体的接合转移分为传导和供给两种形式。传导转移的特点是依赖ｒｅｃＡ介导的重组，协助质粒本身也是从大肠杆菌转移到农杆菌中，转化率高，又称为动员。 将三种相关菌种混合在一起培养，进行杂交，该三种菌株分别是：含有辅助质粒的大肠杆菌菌株，如ｐＧ２含有ｐＧＪ２８和Ｒ６４ｄｒｄ１１质粒：含有重组的中间载体的大肠杆菌菌株，如ｐＬＧＶ１１３０的ｐＢＲ３２２：含有受体Ｔｉ质粒的农杆菌菌株，如ｐＧＶ３８５０.在混合培养中，通过杂交使辅助质粒先转移到含有重组中间载体的菌株中，然后中间载体再被动员和转移到农杆菌中去。 1)中间载体必须含有与受体Ti质粒T-DNA同源的序列，在其被引入到根瘤菌后可被高效的与受体Ti质粒的T-DNA进行重组。 2)具有一个或多个细菌筛选标记，方便筛选共整合 质粒。 3)必须具有bom位点，在有诱导质粒存在的时候情况下，该位点的存在可以使中间载体在不同的细菌中间转移。 4）具有植物细胞选择标记，以利于植物转化细胞的筛选。 5）含有多克隆位点，以便于外源基因的插入。 6）不一定需要有Ti质粒的边界基因。 应用： 这种载体能把T-DNA转入植物细胞基因中，又不会使植物产生冠瘿瘤，而且由于T-DNA上存在着pBR322DNA序列，使他成为一种通用受体质粒，任何可以克隆到pBR322派生的给体载体上的外源基因都可以都可以通过同源重组而方便的插到T-DNA边缘区之间，形成质粒的共和体。 缺点 ①由两个质粒重组而成，故分子较大，构建比较困难。 ②共整合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关，相对较低，必须用Southern杂交或者PCR对共整合载体质粒进行检测。 所以该方法不常用。 * Free template from ㈡双元载体系统 它由微型Ti质粒和辅助Ti质粒构成，T—DNA和Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T—DNA转移到植物细胞基因组内。 微型质粒：含有T—DNA边界缺失Vir基因的Ti质粒，为一个光谱质粒。 辅助质粒：含有Vir基因但缺失T—DNA的突变型质粒，完全丧失致瘤的功能。 应用最广泛的是PBin19微型质粒 ①含有来自PTIT37的T—DNA左右边界序列。 ②含有植物选择标记npt- Ⅱ 基因。 ③含有来自噬菌体M13mp19的lacZ基因。 ④在lacZ基因内部含有多克隆位点，外源基因插入可使之失活。 ⑤含有一光谱宿主质粒RK2的复制和转移的起始位点，质粒小，宿主广。 * 最常用的辅助质粒是根癌农杆菌LBA4404所含的PAL4404，它为章鱼碱型Ti质粒PTiAch5的衍生载体。 主要作用是提供vir基因功能，激活处于反式位置的T—DNA的转移。 * Free template from 双载体系统的构建示意图 * Free template from