上海师范大学分子生物学5DNA损伤修复及基因操作概述-kaigy.pptVIP

遗传工程范畴 DNA序列分析，以及由此派生的蛋白质序列分析(参见J2)。 对基因启动子及其他调控序列的分离与分析(参见J4)。 通过大量正常和突变形式的产物研究来了解这些蛋白质/酶/RNA 的功能(参见J5)。 突变的鉴定，例如由于基因缺陷导致形成的疾病(参见J6)。 生物技术，如蛋白质及其他重要生物功能的分子如人胰岛素和 生长素的大规模工业化生产(参见J6)。 工程动物、工程植物以及基因治疗(参见J6)。 改变了特性的工程蛋白质(参见J6)。 附录 实验I、质粒DNA的微量提取（碱裂解法） 一、实验目的与原理简介 质粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用和最基本的技术之一。分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。学习并掌握质粒的提取纯化的方法。 二、试剂配置 STE：0.1M NaCl, 10mM Tris-Hcl(pH8.0), 1mM EDTA 溶液I：50 mM 葡萄糖,25mM Tris-Hcl(pH8.0),10mM EDTA 溶液II：0.2M NaOH,1%SDS,(注意：一定要现用现配) 溶液III（100 mM）：0.5M KAc 6.0ml, 冰醋酸 11.5ml,水28.5ml 氯仿：异戊醇（24：1）：24份氯仿与1份异戊醇混合均匀即可。 三、实验操作（碱法小量制备质粒DNA ） a.挑单菌落（阳性克隆）接种于LB（含相应抗生素）液体培养基中，培养(37℃,200rpm)8h，再将此活化的菌液取400ul于20ml含相应抗生素的液体培养基中（1/50），250rpm, 37℃培养2h，即可获得经扩大培养的菌液； b.取1.5ml菌液，4℃ 12000rpm，离心1min，去上清；再重悬于0.5ml STE ，4℃ 12000rpm离心30sec，去上清； 注意：去上清可采用剪去枪尖的枪头来吸干净 c.沉淀加入100 ?l 冰上预冷的“溶液 I”，剧烈震荡重悬的菌体； d.加入200 ?l 新配制的“溶液 II”，盖紧管口，快速颠倒5次混匀，不要震荡，确保内表面均与溶液 II接触，冰上3-5min； 注意：该步时间切勿超过5 min e.加入150 ?l 冰上预冷的“溶液 III”， 盖紧管口，倒置试管，温和震荡(缓慢倒转几次即可)5sec，冰上5min； 注意：动作要缓和，以防机械切力对DNA的断裂作用 f.4℃高速离心5min(13000rpm) ，将上清转移至新的1.5 ml eppendorf离心管中； g.加等体积的苯酚:氯仿（1:1），并振荡混匀, 4℃, 12000 rpm离心2min，将上清转移至新的离心管中； 注意：取上清时，宁可损失一部分DAN，也不要将沉淀吸入，否则会出现蛋白污染。为了充分的去除残余的蛋白质，可将此步重复一次。 i.加入等体积的异丙醇（或2倍体积的无水乙醇），震荡混匀，室温放置2-5 min； j.4℃ 高速离心5min去上清，倒置eppendorf管，除尽液体。加300 ?l 70%的乙醇洗涤沉淀(以去掉沉淀的盐)； k.高速离心30sec，小心去掉上清； l.空气中干燥DNA10min，加30-50 ?l的TE溶液（加入的RNase终浓度为20 ?g/ml）溶解沉淀，65℃培养30min去除RNA；-20℃保存 四、质粒DNA的电泳分析 在细胞中，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）常常以超螺旋形式存在，如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，则形成松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA,ocDNA）.在电泳中，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比开环和线状DNA的泳动速度快，因而在电泳凝胶中呈现三条带（如图3.1） 图4.1 抽提的质粒DNA电泳图 G2-3 碱裂解 Alkaline lysis 菌体沉淀重悬于悬浮缓冲液 Resuspend the cells in a buffer solution 用溶菌酶降解菌体细胞壁 Lysozyme to digest the cell wall (optional) 细胞裂解液即含去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)的碱性NaOH溶液 Cell lysis in lysis buffer containing SDS (disrupts cell membrane and denatures proteins) and NaOH (denatures DNA) 用高浓度pH5的乙酸钾溶液中和。其作用是沉淀已变性蛋白质和染色体DNA及大部分去污剂（十二烷基硫酸