《基因芯片技术》第2章-基因芯片的制作.ppt

98-10-23 基因芯片的示意图 DNA Chip Technology Solid support (glass, membrane, plastic, silicon) Miniaturized array of DNA (genetic material) Work on the biochemical principle of DNA/DNA hybridization Hybridized probes (DNA molecules) are fluorescently labeled 一、常见的基片类型 1 膜 2 玻片 3 三维基质包被玻片 4 微板型 5 集成电路型 1.膜型 2202芯片点样仪? 生产商 Bio-Rad? 性能介绍 分辨率：1.25um(x，y轴)和0.25um(Z轴) ， 重复性：3um 球面精确性：l0um 一次制成芯片数：126块芯片 每块玻片点样量82,000个点 合成后点样板 二、非接触式点样法　压电打印原位聚合技术 把探针固定在玻璃表面 封闭玻片未点样的区域：防止杂交时与样品DNA非特异性结合。 第五节 原位合成法一、原位光刻合成 由美国Affymetrix公司开发 思考题： 1 基因芯片的制作方法有哪些？ 2 基因芯片的基片种类有哪些？ 3 选择芯片时应考虑哪些因素？ 4 在对基因芯片进行修饰时，手臂分子的作用是什么？ 5 探针分为哪几种类型？如何制备？ 6 点样针的种类有哪些？各有什么特点？ 7 喷墨点样法的特点？ 8 光导原位合成法的原理和特点？ 9 无掩膜原位芯片合成技术的原理和特点？ The End Thank you 2 寡核苷酸探针 采用原位合成和合成后点样固定两种方法 合成方法：传统的DNA合成方法 合成后点样方式：制备DNA，要进行5’氨基修饰，并设计一个手臂分子Oligo-10dT-NH2-5’；60-70bp，选取特异性高的片段 商业化的寡核苷酸探针：人，小鼠，大鼠，酵母，疟原虫等 比如，全基因组寡核苷酸探针。8327人类基因，5002个小鼠基因，近4000个的大鼠基因 3 基因组DNA探针 BAC基因组文库微阵列 YAC基因组文库微阵列 外显子阵列 第四节　点样仪及点样过程 　 一、接触式点样法 1 实心针“复制器” 实心针侵入源板中蘸取样品，提起后在针的顶端形成一定体积的液滴，移动到玻片相应位置上，接触基片把样品转移，形成样点。不断重复这一过程，直到完成。 特点： 取样一次，点样一次 芯片上的点距离源样品距离不一样，样品蒸发使得点样直径不同 需要严格控制湿度，但湿度太高影响样品干燥 2 鹅毛笔针和裂隙针 毛细原理：在细缝中形成一段样品的液柱，然后在三维工作平台作用下转移到相应的位点，向下轻触玻片，将一定体积液体转移，形成样点。 特点：细缝容易堵 3 毛细管笔 不用每次取样，但是也爱堵 4 针与环结构 环取样，针点样 没有死腔，不会造成样品残留，无污染 不堵 样点均一 缺点：用样品多，样品浓度随时间增加而变浓 其装置与普通的彩色喷墨打印机并无两样，所用技术也是常规的固相合成方法。即，将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂替代，支持物经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机，将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相原位合成技术。如此类推，可以合成出长度为40到50个碱基的探针。 优点：设备廉价，技术相对简单，反应产率高 缺点：点阵密度低，易产生交叉污染 三、点样后处理 步骤： 1）把玻璃基片上的活性羟基修饰上光保护基团，此光保护基团可被一定波长的光激活并脱保护。 2）根据所要制作的阵列的需要设计光刻掩膜。将掩膜（M1）覆盖在修饰过的基片上，用光照射使曝光区域的基片表面脱除保护基团而形成活性羟基（1-2）。 3）引入5`端被X基团保护、3`端被活化的单核苷酸dNTP，使dNTP的3`端与基片上的活性羟基缩合，洗去未有效结合的dNTP（3）。 4）更换掩膜M2，重复1-2，直到所需要的探针阵列合成完毕（4-6）。 Peter J. Russell, iGenetics: Copyright ? Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings. Affymetrix array synthesis Affymetrix芯片介绍 GeneChip以边长12.7cm(5英寸)的正方形石英片为材料，进行生产。 石英片是天然羟基化的基质，表面均匀的羟基化具有结合其它化合物的良好特性。 硅烷化石英片：硅烷膜为探针合成提供密度均匀的羟基；附着在硅烷膜上的连接分子则提供了可以在空间上被光激活的表面