分子生物学CH6-PCR技术与应用.pptVIP

PCR技术及其应用 申川军 广州中医药大学生物化学教研室 参考书 背景 由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基因”。 但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了 DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人 们遗忘。 １９８３年，在Ｃｅｔｕｓ公司工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段ＤＮＡ的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州１０１号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段ＤＮＡ的简单方法，即ＰＣＲ。 在１９８５年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了链反应。大家很快地纷纷采用这个方法，很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这么做。Ｃｅｔｕｓ给了Mullis一万美元的奖金，随后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。ＰＣＲ被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。 １９９３年， Kary Mullis因此获得诺贝尔化学奖。 PCR只是一个简单的不起眼玩艺 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis) PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。 … 它最大的特点就是能不断推出新形式。 ——Paul Rabinow PCR技术 # PCR 反应五要素： # 反应分为三步： # PCR原理： # PCR实验方法 1. 向无菌的200或500μl Eppendorf管中依次加入以下溶液 2. 反应体系混匀，离心 3. 在PCR仪上设定以下程序： 4. 取20μl反应液加4μl Loading buffer在1.2％琼脂糖凝胶上90-120V，电泳30-50min。 5. 在凝胶自动成像系统上观察记录实验结果 # PCR的种类 逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR） ???反向PCR（inverse PCR） ?? 嵌套式PCR（nesting PCR） ?? 原位PCR（in situ PCR） 荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR） 多重PCR（multiplex PCR） 实时PCR （Real-time PCR） 多重等位基因PCR（multiplex allele PCR） ?? 不对称PCR（asymmertric PCR） ???锚定PCR（anchored PCR） ???长片段PCR（long fragment PCR） RT-PCR 反向PCR- cDNA 5’-端的快速扩增/5’-RACE 差异显示PCR 又名mRNA 差异显示PCR（mRNA differential display PCR，DD-PCR） 又名差异显示反转录PCR（ differential display reverse transcription PCR，DDRT-PCR） 某组织总mRNA 12种3’锚定引物 （T12MA、T12MG、T12MC、T12MT） 反转录酶 12种cDNA第一链 24~26种5’十聚随机引物分别与 第一链进行PCR反应(288~312次) Taq 聚合酶 cDNA双链