南京医科大学-现代实验技术概述.pptVIP

现 代 实 验 技 术 概 述 南京医科大学儿科医学研究所 辜 楠 研 究 思 路 整 体（动物模型、ELISA ） 组 织、细 胞（组织、细胞培养） 分 子（RNA、DNA、Protein） 基 因（基因克隆） 整 体 研 究 动物模型 自发性动物模型（Spontaneous Animal Models）是指实验动物未经任何有意识的人工处置，在自然情况下所发生的疾病。这类模型在遗传病、代谢病、免疫缺陷病、内分泌疾病和肿瘤等方面的应用正日益增多。 诱发性或实验性动物模型（Experimental Animal Models）是指研究者通过使用物理的、化学的和生物的致病因素作用于动物，造成动物组织、器官或全身一定的损害，出现某些类似人类疾病时的功能、代谢或毒使动物患相应的传染病，又如用化学致癌剂、放射线、致癌病毒诱发动物的肿瘤等。是药物筛选研究工作所首选。 整 体 研 究 ELISA—酶联免疫吸附测定 （Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ） 原理: 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量呈一定的比例，由此进行定性或定量分析。 ELISA ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 三个必要的试剂： （1）固相的抗菌素原或抗体，即“免疫吸附剂” （immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate） （3）酶反应的底物。 ELISA 双抗体夹心法测抗原 组织、细胞培养 培养：将取得的组织、细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。 组织、细胞培养 组织块培养：直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。 细胞培养：一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。 培养条件 完全培养基：由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成。 条件：37度、5％CO2、合适的PH 关键：无菌 免疫组织化学 基本原理 用抗原和抗体特异性结合的原理和特殊的标记技术，对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的显色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电镜观察。 免疫组织化学（Immunohistochemistry）技术在细胞、染色体或亚细胞水平原位检测抗原分子，是其它任何生物技术难以达到和代替的。它能在细胞、基因和分子水平同时原位显示基因及其表达产物，形成了新的检测系统，为生物学、医学和各个领域分子水平的研究与诊断，开拓了广阔的前景。 分子水平研究 转录 翻译 DNA RNA Protein 逆转录 中 心 法 则 核酸提取 分类： DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量 DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等 非细胞形式存在的病毒和噬菌体（或只含DNA，或只含有RNA） 核酸制备步骤 总RNA的提取 RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径： 1)提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来； 2)直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相 关键的是抑制ＲＮＡ酶活性 TRIZOL 法 TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。