2.2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数上课.pptVIP

二 实验设计 1. 实验设计的内容包括： 2. 实验流程： （1）土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土 3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备 好的信封中。 实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。 土壤细菌绝大多数分布在距地表约3~8cm的土壤层 二 实验设计 （2）样品的稀释 二 实验设计 （2）样品的稀释 样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。 （1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液 （2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液 （3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液 原则：确保平板上的菌落数在30～300之间。 将待测样品经过一系列的稀释，然后选择三个 稀释度的菌液均匀涂布在平板上，然后培养。 将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛有9 mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。 由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。 为了结果接近真实值，可将同一稀释度菌液涂 布到3个或3个以上的平板上，经培养，计算出 菌落的平均数。 　 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 　　答：这是因为土壤中各类微生物的数量是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。 因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。 （3）取样涂布 ◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。 ◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。 （4）微生物的培养与观察 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。 将涂布好的培养皿放在30 ℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。 比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。 （4）微生物的培养与观察? 微生物的培养与观察 （5）鉴定：筛选后必鉴定 鉴别培养基：不影响微生物的生存 挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-10的颜色反应。如果有则说明该选择培养基中确实含有能分解尿素的细菌。 酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性 酚红在低pH值时呈现黄色,在高pH值时呈现红色 三、操作提示 无菌操作 做好标记 制定计划 （一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。 （二）获得某一稀释度下，菌落数30～300的平板，在这以稀释度下是否至少有两个平板的菌落数相接近？ 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。 四.结果分析与评价 （三） 如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，教师需要引导学生一起分析产生差异的原因。 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 五.课题延伸 菌种的进一步鉴定 （1）原因：由于分离分解尿素的细菌的选择培养基上可能生长着以分解尿素的细菌的代射产物为氮源的其它微生物。 （2）原理：CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3；由于NH3的产生，培养基碱性增强，pH升高，因此可通过检测pH的变化来判断该化学反应是否发生。 （3）方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，则pH升高，说明该种细菌能分解尿素。 脲酶 测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊