第五章 外源基因在大肠杆菌中的表达--幻灯片.pptVIP

第五章 外源基因在大肠杆菌中的表达 一、大肠杆菌表达体系的优越性： 1. 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解； 2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体； 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达； 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。 二、大肠杆菌中表达体系的不足： 1、真核基因在大肠杆菌中很难表达出天然蛋白质。 1） E. coli不能加工成正确的重组蛋白。细菌和高等生物的加工过程是不同的。特别是一些动物的蛋白要进行糖基化。糖基化在E. coli中是非常罕见的，在E. coli中合成的蛋白不能正确的糖基化。 2） E. coli不能正确的折叠蛋白，形成无活性蛋白。如果蛋白不能进行正确的折叠，其三级结构往往是不溶的，在细菌中形成包涵体。这样在细菌中提取蛋白不存在问题，但将蛋白转化为正确的折叠方式是比较困难的甚至是不可能的。 2、 E. coli可能降解重组蛋白。 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。重组蛋白降解的问题可以使用一个或多个蛋白酶突变E. coli来解决。  3、真核基因在大肠杆菌中的表达受限 1）真核基因可能含有内元，E. coli缺乏切除内元的机制。 解决方案：如果克隆的基因含有内元，可以使用mRNA。 2）真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。 3）基因的密码子可能不适合于E. coli中翻译。总体上讲，所有的生物都共用相同的密码子，但每一种生物都有偏爱的密码子，表现在tRNA识别不同密码子的效率不同。 解决方案：使用E. coli偏爱的密码子。 4）真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。 第二节大肠杆菌表达载体 一、克隆基因正确表达的基本条件 最基本条件： 应该能够进行正常的转录和转译，以及在正常情况下还与转译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。 重要条件： 编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性。 二、大肠杆菌表达载体表达外源蛋白的基本条件 具有核糖体结合位点； 具有克隆基因的功能（强）启动子； 具有插入外源序列的正确取向。 1.启动子： 最佳启动子具备的条件： 第一 必须是强启动子，能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上； 第二 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件； 第三 这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。 2. 转录终止子 启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。 3. 转译起始序列 5’-末端结构特征，决定mRNA的转译起始效率。 在核糖体结合位点（RBS）的序列结构中，增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷残基含量的比例，诱发碱基发生定点突变；或使用转译偶联系统进行克隆基因表达。 4.转译增强子 显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。 5. 转译终止子 mRNA转译终止必须存在终止密码子。 大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下，转译终止的效率便会得到进一步的增强。 三、常用的大肠杆菌表达载体 1. Lac启动子的表达载体 2. Trp启动子的表达载体 3. PL启动子的表达载体 三启动子串联单元表达效率高于单启动子单元。 1. Lac启动子的表达载体 控制编码β-乳糖苷酶的lacZ基因转录的序列，可以被IPTG所诱导，所以加入诱导物后，可以诱导启动子下游的外源基因的表达。 2. Trp启动子的表达载体 色氨酸启动子可以被色氨酸抑制，也可以很容易的被3-β-吲哚丙烯酸诱导。 这种表达载体的优点是，它所合成的蛋白质产量高于lac启动子表达载体系统，并且是诱导型的。 Trp启动子表达载体已用来生产了α-干扰素和γ-干扰素。 3. PL启动子的表达载体 是负责λ DNA分子转录的启动子之一。PL启动子是可以被E. coli RNA聚合酶所识别的强启动子，转而转录噬菌体DNA。该启动子可以被λcI基因产物所抑制。携带PL启动子的载体使用温度敏感的E. coli cI突变体。在较低的温度下，突变体所产生的cI蛋白可以抑制 PL启动子，在较高的温度下，蛋白失活可以导致克隆基因的转录。