第一章 提取与沉淀分离技术课件.pptVIP

在动、植物和微生物材料中，有效成分的含量一般较少；稳定性较差，大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感；易被微生物分解变质。 材料的采集会大大影响实验的成败,选用的材料不同，有效成分的含量就不同；同一材料的部位或生长期不同，有效成分的含量也不尽相同。 总的来说，材料选择应遵循的原则是，有效成分含量多、稳定性好；来源丰富、保持新鲜；提取工艺简单、有综合利用价值等。 用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主要有二种 ： 1）、加入饱和溶液法 要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高 V= V0(S2-S1)/（1-S2） V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0:原溶液体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；S1:原溶液的硫酸铵饱和度。 饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至50－60℃，趁热滤去沉淀，再在0℃或室温平衡1－2天，有固体析出时达100％饱和度。 在0.14mol/L的氯化钠溶液中， RNP 的溶解度相当大，而DNP的溶解度仅为在水中溶解度的1%； 当氯化钠的浓度达到1mol/L的时候， RNP的溶解度小，而DNP的溶解度比在水中的溶解度大2倍。 所以，常选用0.14mol/L的氯化钠溶液提取RNP，而选用1mol/L的氯化钠溶液提取DNP。 技术2：细菌质粒DNA的提取法 本方法包括SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分等内容。 仪器： 同技术1； 试剂： TE、TAE缓冲液；10%SDS；５ＭNaCL；20mg/ml蛋白酶Ｋ；CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL? 4.1gNaCL 溶于80ml水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解)；酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)；氯仿/异戊醇(24：1)；异丙醇；70％及100%乙醇 第四节 核酸的提取与沉淀分离 第三节 沉淀分离 盐能够改变蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度有密切关系。两者的关系可用下式表示： lg（S/So ）= -KsI S为蛋白质在离子强度为I时的溶解度(g/L)；So为蛋白质在离子强度为0时的溶解度；Ks为盐析常数；I为离子强度。 在温度一定的条件下，某一蛋白质在某一pH值的水溶液中的溶解度为一常数So。故上式可 改写为： lgS = lgSo – KsI = β – KsI β=lgSo为一常数 β值主要取决于蛋白质的性质，也与溶液的温度和pH值有关 ； 盐析常数Ks主要与盐的性质(离子价数、平均半径等)和蛋白质的结构有关，Ks越大， 盐析效果越好。 盐析沉淀法 第三节 沉淀分离 所以对某一蛋白质来说，在温度和pH值等盐析条件确定(即β确定)，所采用的盐确定(即Ks确定)以后，蛋白质的溶解度决定于离子强度I, 可用下式计算： I = 1/2 ∑miZi2 mi:溶液中离子的摩尔浓度 Zi：离子的价数 对于多种蛋白质或酶的混合液，可采用分段盐析法进行分离纯化。 盐析沉淀法 第三节 沉淀分离 2.盐的选择： 蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广的是硫酸铵。 硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好的安定作用。又因为其离子容积较大，吸走水分子的能力也大，成为有效的盐析工具。 硫酸铵在水中的溶解度大而温度的影响小( 25℃时溶解度为4.1mo l/L，即767g/L;0℃时溶解度为3.7mol/L，即697g/L)，而且价廉易得，不易引起蛋白质变性，分离效果比其他盐好。 但是，用硫酸铵盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子会干扰蛋白氮的测定，故有时也要用其他盐来进行盐析。磷酸钾和硫酸钠的盐析系数Ks较大，但由于在较低温度下的溶解度太低,受温度影响大，故应用不广泛。 盐析沉淀法 第三节 沉淀分离 3.硫酸铵浓度的计算与调整方法 : 通常硫酸铵的添加以百分饱和度来表示 (不是浓度百分比)，例如大部分蛋白质可在 80% 硫酸铵饱和度下沉淀。因为硫酸铵加入的体积很大，会改变最后的总体积，很难由浓度百分比来计算， 因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。 盐析沉淀法 第三节 沉淀分离 2）、加入固体盐法 要求：饱和度高，不增大溶液体积 t=G(S2-S1)/（1-AS2） S2，S1:分别代表所需达到的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度；t：将1L S1饱和度的溶液提高到S2饱和度时所需加进的硫酸铵克数；G,A：常数，与温度有关。 实际使用时，t可直接查表得到。（注意：