第七章 色谱分离技术-凝胶筛分1课件.pptVIP

色层分离技术 色层分离：是一组相关技术的总称，也称为色谱 分离或层析分离。 惯用法 按固定相的基质（载体）类型分类： 层析：载体一般为软基质的凝胶，常用的有纤维 素、琼脂糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、 聚丙烯酰胺凝胶等，只适合在低压下操 作。 色谱：载体一般为高强度的经过表面该性的硅胶、 聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，适合在高 压下使用。 也有人将层析称为色谱。 用途：用在产品的精制阶段，目标是获得合乎使 用要求的产品。 色层分离原理 当两相作相对移动时，利用溶质在互不相溶的两相中吸附或分配的差异，引起移动速度的不同而进行分离的方法。 分 类 流动相与固定相： 流动相：可为气相、液相、超临界流体等 固定相：固体、液体和以固体为载体的液体薄层 固定相的形状： 纸层析 薄层层析 柱层析 操作压力 低压：﹤0.5 MPa 中压：0.5-4.0 MPa 高压：4.0-40 MPa，用于分析目的 分离操作模式 洗脱展开：最常用 前沿（迎头）分析 顶替展开 分配机理 根据溶质和固定相间的作用机理 凝胶过滤 离子交换 反相色谱 疏水层析 亲和色谱 常规的色层分离 色层分离过程包含两部分： 固定相：载体或载体+功能基团 流动相（洗脱液）：缓冲液或有机溶剂 对于高压液相色谱和低压层析，操作模式有很 大区别。 液相色谱的基本原理和参数 保留时间(tR)和保留体积(VR) 从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间，用tR表示。在这段时间内冲洗剂（流动相） 流过的体积为保留体积，用VR 表示。 容量因子k? 和平衡常数K 某物质的k?定义为在分配平衡时该物质在两 相中绝对量之比。 而平衡常数K为平衡时，物质在两相的浓度比： Vs和Vm分别为柱内固定相和流动相所占的体 积。于是有 在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向 前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移 动速度( )总是小于流动相的移动速度( )，而等于流 动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时 间分数之积： 而当柱长一定时，溶质谱带的移动速度和流动相的移 动速度与它们通过柱子所花费的时间成反比： 当柱外死体积可忽略不计时， 选择性( )和相对保留值( ) = = 柱效率： 塔板高度（H）和塔板数（N）是衡量色谱柱 效率的两个重要指标。 塔板高度（H）：在某一段柱长范围内溶质在固定相和流 动相之间达到分配平衡，这段柱长就相 当于一个理论塔板的高度(HETP或H)。 理论塔板高度 为： 式中， ? 柱长。 塔板高度小，塔板数高，色谱分离效率高。 影响柱效的因素 1）理论塔板高度（ ）随填料粒度减少而减少； 2）在一定范围内流速减小有利于提高柱效； 3）减少冲洗剂粘度或提高柱温有利于 减小； 4）分子量较小的样品分子 较小。 凝胶过滤层析（体积排阻色谱） Gel filtration chromatography,GFC Size exclusion chromatograpy，SEC 是一种纯粹按照溶质分子在溶液中的体积大 小进行分离的层析技术。 应用：主要用于蛋白质等生物大分子的分级分离 和除盐。一般用作原料液的初分离，获取 几个不同分子量物质分级，供进一步分离 纯化使用。 分离原理： 含有不同分子大小的样品进入色谱柱（层析 柱）后，较大的分子不能通过孔道扩散进入填料 颗粒（凝胶珠体）内部，而与流动相一起先流出 色谱柱（层析柱）。较小的分子可通过部分孔道、 更小的分子可通过任意孔道扩散进入颗粒（珠体） 内部。这种颗粒内部扩散的结果，使小分子沿柱 流动的速度减慢，使混合样品中不同的分子按分 子大小的顺序流出色谱柱（层析柱）从而达到分 离的目的。 凝胶过滤介质：良好的凝胶过滤介质应满足如 下要求