β–葡聚糖酶活性测定.docVIP

β-葡聚糖酶活性测定 β-葡聚糖是由葡萄糖单体通过β-1，3和β-1，4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合物，它主要存在于单子叶禾本科谷实中的糊粉层和胚乳细胞壁中。β-葡聚糖酶属于水解酶类，能有效地降解β-葡聚糖分子中的β-1，3和β-1，4糖苷键，使之降解为小分子。由于在饲料中，大麦的β-葡聚糖含量较高，难以被单胃动物消化利用，而且对饲料中各种养分的消化利用具有明显的干扰和抑制作用，成为麦类饲料中的抗营养因子。在饲料中添加β-葡聚糖酶，能有效地消除β-葡聚糖的抗营养作用，促进饲料中各种养分的消化和吸收利用，增进畜禽健康。在啤酒生产中，添加β-葡聚糖酶可以加快麦汁和啤酒的过滤速度、提高麦汁得率、增加可发酵糖的含量。此外，β-葡聚糖酶在造纸工业、日化工业等其它许多方面也有着广泛的应用，对β-葡聚糖酶的研究将越来越受到人们的重视。 β-葡聚糖酶活力的测定方法主要有3种：还原糖测定法（分光光度法）、粘度测定法和底物染色法。其中还原糖测定法简便实用，比较准确，而且结果重复性好，是广泛使用的一种酶活测定方法。其原理是：β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖，其具有的还原基团在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应，显色的深浅与还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比，因此，可以利用比色测定反应液的吸光度值来计算还原糖的生成量，从而得出β-葡聚糖酶的活力。但在该测定方法的具体操作中存在一些影响酶活力测定结果的因素，本文即对还原糖法测定β-葡聚糖酶活力的几个重要影响因素进行研究，并得出最佳测定条件。 1 材料与方法 1.1 菌株与培养基 1.1.1 发酵产酶菌株 黑曲霉（Aspergillus niger）A47菌株，由本实验室保藏。 1.1.2 固态发酵培养基 麸皮70 g、米糠27 g、NH4NO3 2.95 g、微量元素液 0.05 ml、蒸馏水100 ml，pH值5.0，121 ℃灭菌20 min。 微量元素液的组成为：2 mol/l HCl溶液 5 ml、FeSO4 2.5 g、MnSO4·H2O 0.98 g、ZnCl2 0.83 g、CoCl2 1.0 g、蒸馏水100 ml。 1.1.3 发酵培养条件 250 ml三角瓶装10 g培养基（干料计），接种量为每瓶0.5 ml孢子悬液(1.0×107 cfu/ml)，发酵温度30 ℃，培养48 h。 1.2 试剂与溶液 1.2.1 β-葡聚糖溶液 准确称取0.7 g β-葡聚糖(Amresco)，加入5 ml无水乙醇润湿，再加入80 ml缓冲液，同时缓慢加热直至β-葡聚糖完全溶解，冷却至室温，用缓冲液定容至100 ml，底物溶液4 ℃保存，2 d内用完。 1.2.2 葡萄糖标准贮备溶液(10 mg/ml) 称取烘干至恒重的无水葡萄糖1 g，精确至0.1 mg，用水溶解并定容至100 ml。 1.2.3 葡萄糖标准溶液 分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0.00、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 ml于10 ml容量瓶中，用水定容至10 ml，盖塞，摇匀备用。 1.2.4 DNS试剂 称取3，5-二硝基水杨酸10 g，置于约600 ml水中，逐渐加入氢氧化钠10 g，在50 ℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸钾钠200 g、苯酚(重蒸)2 g和无水亚硫酸钠5 g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1 000 ml，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7 d后使用。 1.2.5 粗酶液的制备 取5 g固体发酵曲于250 ml三角瓶中，加入缓冲液50 ml，振荡抽提1 h，过滤离心去除孢子后，4 ℃保存备用。 1.2.6 缓冲液 乙酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲配制液见叶宝兴主编《生物科学基础实验》（2005）。 1.3 标准曲线的制作方法 按表1规定的量，分别吸取葡萄糖标准溶液、缓冲溶液和DNS试剂于各管中（每管做3个平行样），混匀。将标准管同时置于沸水浴中，反应10 min。取出，迅速冷却至室温，用水定容至25 ml，盖塞，混匀。在波长550 nm处测量吸光度。以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。 1.4 酶活力测定方法 取2支25 ml刻度具塞试管，分别加入1.5 ml 0.7% β-葡聚糖底物溶液（由pH值5.6乙酸-乙酸钠缓冲液配制），置55 ℃水浴中保温5 min。在其中一支试管中加入0.5 ml稀释酶样，混匀，置于55 ℃水浴中准确反应30 min，加入3 ml DNS试剂至两支试管中，混匀。在另一支试管(空白管)中加入0.5 ml稀释酶样，同时将两支试管放入100 ℃水浴中反应10 min，取出置于冷水中冷却至室温，加水定容至25 ml，盖塞混匀，在550 nm处测量酶样