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萝卜游离小孢子成胚诱导影响因素研究进展 　　摘 要：综述了影响萝卜小孢子培养中胚状体发生的主要因素，包括基因型、小孢子发育时期、小孢子的处理方式、培养基类型及其添加物等，同时提出了该技术存在的问题，并展望了这项技术在研究和生产实践中的应用前景 关键词：萝卜；游离小孢子培养； 胚状体诱导；影响因素 中图分类号：S631.1 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2016）14-0041-04 萝卜（Raphanus sativus L.）为十字花科萝卜属的一二年生草本植物，以肥大肉质根为产品器官，是我国重要的蔬菜作物。异花授粉作物的杂种优势明显，在萝卜杂交优势育种中，人们多利用雄性不育系与自交系所产生的F1代的杂种优势来提高其品质、产量和抗病性。遗传性稳定的纯合自交系是必不可少的亲本材料，常规选育方法获得一个稳定、纯合的自交系一般需要7～8代，费工费时，且长期自交还会出现衰退现象。而运用游离小孢子培养获得纯系是一种行之有效的方法，运用该技术可在2 a内获得遗传稳定的双单倍体（Doubled haploid，DH）植株，从而大大缩短育种周期，提高育种效率。同时由于隐性性状能在DH植株上直接表达，可提高优异重组体与突变体的选择效率，除此之外DH植株还可用于遗传图谱的构建与分子标记等基础研究，小孢子和小孢子胚也是遗传转化的理想受体，因此小孢子游离培养技术应用前景广阔[1] 1989年，Lichter[2]首次通过小孢子培养技术成功获得萝卜胚状体。此后，国内外诸多学者对萝卜游离小孢子技术开展了系统的研究。本文对20多a来国内外有关萝卜游离小孢子培养所取得的成果及其影响因素进行综述，并以此提出萝卜小孢子培养中现存的问题以及对未来的展望 1 影响萝卜小孢子成胚诱导的内在因素 1.1 供体材料的基因型 供体植株的基因型是影响小孢子培养的关键因素，是小孢子胚胎发生起动与否的内在因素，且不同基因型之间小孢子胚胎的发生频率存在显著差异。1996年，Takahata等[3]对11份萝卜材料进行游离小孢子培养，其中只有6份材料获得了胚状体，其基因型发生范围为54.5%，胚胎发生率为0.2～8.3个/105个游离小孢子。随后张丽[4]用20个不同类型萝卜品种为试材，进行游离小孢子培养技术初步研究，发现只有山东板叶心里美1个品种能够形成胚，陈文辉等[5]、周志国等[6]、张振超[7]的研究同样证实了不同基因型萝卜胚状体发生率间存在显著差异。王春丽等[8]进一步研究发现，在22份萝卜材料中，有12份材料获得了胚状体，出胚材料中90%以上为杂种一代，表明萝卜杂种一代较常规品种易出胚，这与赵艳玲[9]的研究结果一致，可能的原因是萝卜胚胎发生能力同其他被证实了的十字花科作物一样，是受染色体上某些基因位点控制，因而表现出较强的杂种优势 1.2 小孢子发育时期 大多数植物小孢子培养的最佳时期为单核靠边期至双核早期，然而小孢子的发育时期与花蕾形态指标相关。花蕾长度是最早用于判定萝卜小孢子发育时期的外在标准。Takahata等[3]发现萝卜材料Chugoku-ao、Sushirazu-shogoin及Minikon的花蕾长度分别为3～4 mm、5～6 mm、4～5 mm时，其小孢子处于单核靠边期至双核早期，此时培养的小孢子胚状体诱导率最高；周志国等[6]、龙雯虹[10]同样证实，不同基因型的小孢子处于单核靠边期至双核早期的花蕾长度不同。李丹等[11]以4份不同萝卜材料为试材，研究了花蕾不同形态指标与小孢子发育时期的关系，结果表明不同材料花蕾纵径、花蕾横径、花瓣长、花药长存在极显著差异，试验材料处于单核靠边期时的花蕾纵径变幅为2.99～3.51 mm，横径为2.11～2.49 mm，花蕾纵横径比为1.41～1.48，花药长度为2.05～2.51 mm，花药宽度为0.83～0.95 mm，花瓣长度为1.89～2.56 mm，瓣药比为0.92～1.06，相比较而言，小孢子发育适期瓣药比在不同材料间的差异相对较小，更适合作为不同材料取样适期的鉴定指标和尺度，这与赵艳玲[9]的研究结果一致。Changhoo等[12]的研究表明，不同萝卜品种小孢子培养最佳花蕾长度在2.5～6.5 mm，但其总体特征是当花瓣约短于柱头长度时小孢子处于单核晚期的比例最大。虽然花蕾形态可作为判断小孢子发育时期的指标，但它随着供体植株基因型、生长条件、生长时间、花序等的变化而变化，故在每次培养前，应对小孢子发育时期进行鉴定 2 影响萝卜游离小孢子成胚诱导的外因 2.1 材料的处理 在进行小孢子培养时对其进行处理，可改变小孢子的生理状态，使分裂方式和发育途径发生变化，促进胚状体的形成，提高胚状体发生率，这项措施在诸多植物上取得了成功。应用在