琼脂糖凝胶电泳检测dna.ppt

* * 紫外透射检测仪 * * * * Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） DNA的泳动受到电泳缓冲液和离子浓度的影响。 缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很慢；离子强度过高，电导率升高，极易产生大量的热能，最严重的结果是凝胶熔化，DNA变性 常用的电泳缓冲液有TAE，TPE和TBE,其中TAE的缓冲容量最低，长时间电泳将被消耗。 * * * * * * （配制浓度依照所提质粒的大小来确定）. 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。 * * * * * * * * * 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 丁新伦 dingxinlun@163.com【一】背景知识 凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术； 分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。 根据制备凝胶的材料: 琼脂糖电泳 凝胶 电泳 聚丙烯酰胺电泳 【二】实验目的 学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 检测碱裂解法提取质粒的结果 检测双酶切法鉴定重组质粒的结果 检测PCR法鉴定重组质粒的结果 【三】实验原理 （1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。 （2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.9～6 1.5 0.2～3 12.0 0.1～2 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA 分子大小来确定。 （3）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可判断DNA分子量大小和粗略估计样品DNA浓度。 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.9～6 1.5 0.2～3 12.0 0.1～2 【四】仪器、材料与试剂 质粒样品、酶切样品和PCR样品。 凝胶电泳系统和电泳图像分析系统(凝胶成像系统)等。 琼脂糖、 1XTBE电泳缓冲液、溴化乙锭、 6X载样缓冲液 （ 6X loading buffer）和DNA分子量标准（ Lambda DNA / EcoRI + HindIII Marker ）等。 凝胶电泳系统 DYY-6C型 ?双稳定时电泳仪电源（北京六一） 输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V)????? 4-400mA?(1mA)????? 240W  美国Bio-rad伯乐 小型水平电泳槽Mini-Sub Cell GT Cell ?凝胶成像分析系统 Lambda DNA / EcoRI + HindIII Marker（Ferments） 一个已知分子质量的DNA样品做最对照，用来确定待测样品的相对分子质量。 常用电泳缓冲液 缓冲液 缓冲容量 迁移速度 分辨率 用途 TAE 最低 最快 (高10％) 高分子量高 高度复杂DNA混合物；超螺旋DNA TBE 很高 较慢 低分子量高 价格昂贵，不常用 TPE 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用： ①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作更方便。 上样缓冲液 溴化乙锭 溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐Ethidium　Bromide，EB），EB染色（EB可很好地掺入到双链DNA中），在紫外光下会发出橙红色的荧光，用于对DNA进行染色和观察。 用于观察的紫外光有３种波长，一般使用中波紫外光（３０２ｎｍ）。 短波紫外光（２５４ｎｍ）观察效果较好，但对DNA的破环很大。 长波紫外光（３６６ｎｍ）：回收。 EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。 EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。 SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。 【五】实验步骤 制备琼脂糖凝胶（1%） 制备凝胶板 加样 电