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IEC的应用及特点 IEC是蛋白质、肽和核酸等生物产物的主要纯化手段。这主要是由于IEC基于离子交换的原理分离纯化生物产物，不仅具有通用性，而且选择性远高于GFC。 IEC柱： φ7.5×75 ，TSK ge1 SP—5PW； A液：0.02mol／L磷酸盐／乙腈(70／30)，pH3.0； B液：0.5mol／ L磷酸盐／乙腈(70／30)，PH3.0； 梯度：线性A→B(30min)；流量＝l.0L／min； 图中：1–催产肽；2–脑啡肽； 3–TRH；4 –α–内啡肽； 5 – LHRH ； 6–神经降压素；7–α-MSH； 8 –血管紧张肽II； 9–P物质；10–β-内啡肽 IEC分离激素多肽 7.5 亲和色谱(Affinity Chromatoraphy，AFC) 亲和色谱是专门用于纯化生物大分子的色谱技术。它基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行分离。 其显著特点是高选择性，且色谱过程操作条件温和，能有效地保持生物大分子高级结构的稳定性，活性样品的回收率也比较高。 7.5.1亲和色谱特点 亲和色谱被广泛用于酶、治疗蛋白、抗体、核酸、辅助因子等生物大分子以及细胞、细胞器、病毒等超分子物质的分离与纯化。 亲和色谱操作示意图(●-目标产物，?-杂蛋白) 7.5.2亲和色谱原理 根据选择性的高低，可将亲和色谱分为专一性和基团性两类。前者的配基仅对某种生物物质有特别强的亲和性，如单克隆抗体对抗原的特异性吸附就属此类。后者则指固定相配基对一类基团有极强的亲和关系，如一些辅酶(NAD+，NADP+，ATP等)能与许多需要这些辅酶才起催化作用的酶发生亲和结合。 亲和载体选择性好， 但不是任何生物高分子都有特定配基。针对某一生物大分子的分离，需要制备专一的配基，并选择特定的色谱条件。这使亲和色谱吸附剂的商品化受到限制。 亲和色谱所用固定相载体是由对生化物质有特异亲和力的配位体偶联在惰性载体上构成。载体制备过程一般包括3步，即载体(基质)的选择、载体的活化和配基的连接。 7.5.3 亲和色谱载体 国际知名牌号的亲和色谱载体基质： 美国Amicon公司的Matrex CellufineTM(交联纤维系) 法国IBF公司的UltrogelR(聚丙烯酰胺／琼脂糖) 英国Shandon公司的Hyperil WP300TM(硅) 日本东洋曹达公司的Toyopearl，等等 载体基质的特性对分离纯化效果至关重要。常规的亲和色谱载体都是以软质凝胶，诸如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等作为载体材料的。这些载体材料虽然机械强度较差，传质速率低，但在生物技术领域中仍被广泛采用。 亲和色谱中常用一些小分子化合物作为配基制备亲和载体，但小分子的配基直接连接于琼脂糖上常产生无效吸附剂，其原因是由于载体的空间位阻关系，使大分子化合物(亲和物)不能直接接触到配基。解决的办法是在载体和配基之间引入适当长度的“手臂”(间隔基)，以减少载体的空间位阻，增加配基的活动度。作为“手臂”的烃链可以先连接于载体，再通过它连接于配基上。 亲和色谱中引入“手臂”原理 亲和色谱一般采用柱色谱法。洗脱方法有两类：普通洗脱法和专一性洗脱法。 与其他色谱分离一样，可通过改变溶剂或缓冲液的类型，改变缓冲液的pH和离子强度，改变洗脱温度，以及添加促溶剂等措施进行洗脱。 7.5.4 亲和色谱操作和应用 亲和色谱分离在生物制品分离和分析领域有宽广的应用开发前景。 应用亲和色谱分离技术分析血液中纤维蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶原的含量，所用的载体基质为Toyopearl HW65(粒径20～40μm，排除相对分子质量5×106Da)，使用甘氨酰酞替甘氨酸作隔离体，而固定化配位体为p-氨基苯酰脒。其色增分析系统如图所示。 用免疫亲和色谱柱纯化干扰素，产品纯度比原用方法提高近10倍。 亲和色谱分离纤维蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶原分析系统图 1–切换阀门；2 –泵(1ml／min)；3 –调节阀；4 –压力表；5 –注样器； 6 –过滤器；7 –色谱柱(25—30℃)；8 –萤光检出器(蛋白质用)； 9 –集样器(4℃)；10 –两点记录仪；11 –蠕动泵；12 –压力表； 13 –反应盘管(37℃)；14 –萤光检出器(酶活性测定定用) 高效液相层析（HPLC） 特点： ①使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因而分辨率很高。 ②溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。 许多类型的柱层析都可用HPLC来代替，如分配层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。 高效液相色谱仪 Fermentation C