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多重PCR方法同时检测3种转基因作物外源基因 多重PCR方法同时检测3种转基因作物外源基因 转基因作物（GMP）是指利用分子生物学手段，将某些生物的基因转移到作物中去，使其出现原物种不具有的性状或产物[1]。近年来，随着转基因技术迅速发展，转基因作物种植面积不断加大，但其对自然环境安全、人体健康、生物多样性等可能造成的负面影响引起各国的关注。为此，日本、欧盟等开始对转基因作物实行强制性标识制度[2]，同时转基因检测技术的需求大大增加，且对准确性、特异性提出严格要求。我国施行《农业转基因生物标识管理办法》，要求对5类转基因生物涉及的17种转基因产品标识[3]。为贯彻标识制度，需要建立一套方便、实用的转基因产品检测技术。 　　目前，转基因产品检测方法分为DNA检测、蛋白质检测[4]。蛋白质检测方法有试纸条检测、ELISA，DNA检测方法有基因芯片、PCR、Southern杂交等[5-7]。多重PCR技术是在同一PCR反应体系里加入2对或2对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、试剂、操作过程与一般PCR相同[8]。多重PCR技术应用十分广泛，包括动物和植物生物学、人类生物医学、食品卫生等。多重PCR检测方法具有高效、快捷、准确和经济简便的特点。该研究拟通过对多重PCR检测方法进行优化并建立起包括CaMV 35S、NOS、CP4-epsps 3种外源基因的多重PCR检测技术体系。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　1.1.1 试验用材料。所有转基因及非转基因材料均购自欧盟标准物质和计量研究所，市售大米、玉米均购自康定县各大超市及农贸市场。 　　1.1.2 主要试剂。植物基因组提取试剂盒、Master Mix购于成都博瑞克生物技术有限公司；引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成；标准分子量（M）大小依次为100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1 000 bp、1 200 bp；CTAB、SDS等生化试剂均为国产分析纯。 　　1.2 基因的确定与引物的设计 　　根据目前转基因商业化材料的分子特征选择出现几率较高的CaMV 35S、NOS、CP4-epsps 3个基因作为检测基因，引物分别参照国家相关标准中的特异性序列（表1）。 　　1.3 样品DNA提取 　　样品DNA提取按照转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化（农业部1485号公告-4-2010）之试剂盒方法进行[9]，测定提取DNA浓度和质量。 　　1.4 多重PCR方法的建立 　　1.4.1 多重PCR单基因特异性试验。反应体系：2Master Mix 12.5 L，F、R各1 L（10 mol/L），模板DNA 2 L（模板浓度为25 ng/L），本文由论文联盟http://wWw.LWlm.cOm收集整理加ddH2O至25 L。 　　扩增程序：95 5 min；94 30 s，58 30 s，72 30 s，35个循环；72 5 min，4 保存。PCR反应结束后将反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。 　　1.4.2 多重PCR检测方法的建立及条件优化。 　　（1）多重PCR退火温度的优化。反应体系：2Master Mix 12.5 L，3对引物中F、R各0.25 L（10 mol/L），模板DNA 2 L（模板浓度为25 ng/L），加ddH2O至25 L。 扩增程序：95 预变性5 min；94 30 s，退火温度设置梯度50、54、56、58、60、64 30 s，72 40 s，30个循环；72 延伸10 min。PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析，筛选出最佳退火温度。 　　（2）多重PCR引物浓度的优化。反应体系：2Master Mix 12.5 L，3对引物终浓度（mol/L）按照0.20.2∶0.2、0.10.1∶0.1、0.20.2∶0.1、0.10.2∶0.1和0.10.2∶0.1设置引物浓度梯度，模板DNA 2 L（模板浓度为25 ng/L），加ddH2O至25 L。扩增程序选择退火温度优化后确定的程序。PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析，筛选出最佳引物浓度配比。 　　1.5 多重PCR方法的实例应用 　　利用该研究建立的多重PCR检测体系，对实验室保存的已知样品进行实例验证，以期进一步检验建立的多重PCR检测体系的可靠性和准确性。 　　1.6 市售样品检测 　　利用该研究建立的准确、可靠的多重PCR检测体系，对购自康定县各大超市及农贸市场的大米、玉米进行检测，定期掌握康定县市场上是否存在非法存在的转基因作物及其产品。 　　2 结果与分析 　　2.1 提取样品DNA 　　采用试剂盒提取纯化后的样品总DNA通过超微量分光光度计测定浓度和质量，经测定，所有样品浓度都大于