动物微生物学实验2.ppt

实验二 细菌抹片的制备及染色 一.目的要求 1．掌握细菌抹片的制备方法和几种常用的染色方法。 2．认识革兰氏染色的反应特性。 二.革兰氏染色法原理 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 三 实验器材 1、活材料：培养12-16h的大肠杆菌（Bacillus thuringiensis）及链球菌. 2、染色液和试剂：结晶紫、革兰氏碘液、95%酒精、碱性复红、二甲苯、香柏油 3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜 四.操作步骤 染色是细菌学上一个重要而基本的技术。由于细菌个体微小，且半透明，如不经染色往往不易识别。因此，借助于染色法可使细菌着色，与背景形成鲜明的对比，便于在显微镜下进行观察。也可根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。 (一)、载玻片处理 载玻片应清晰透明，清洁而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，如有残余油渍，可按下列方法处理 1.滴上95％酒精2～3滴，用清洁纱布擦拭,然后以钟摆速度通过酒精灯焰3～4次。 2.若上法仍未能除去油渍，可再滴上1～2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。 (二)、涂片方法 1.菌落涂片方法 2.菌液涂片法 3.血液涂片方法 4.组织涂片方法 (三)干燥 (四)固定 1.火焰固定 2.化学固定 (五)染色 1.单染色法 美蓝染色法 2.复染色法 –a.革兰氏染色法 草酸铵结晶紫染色液---革兰氏碘液--- 95％酒精---10倍稀释石炭酸复红液 b.抗酸染色法 c.瑞特氏染色法 d.姬姆萨氏染色法 e.荚膜染色法 f.芽胞染色法 g.鞭毛染色法 甲菌 乙菌 媒染 碘液 脱色 乙醇 复染 复红 紫色（G＋） 革兰阳性菌 (Gram positive bacteria 红色(G-革兰阴性菌 (Gram negative bacteria) 初染 结晶紫 革兰氏染色 五 注意事项 1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。 2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。 3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。