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实验四 线粒体的分离与鉴定 实验简介 线粒体是真核细胞内一种重要和独特的细胞器，人体内 线粒体是真核细胞内一种重要和独特的细胞器，人体内 的ATP 的ATP 内的“能量加工厂” 内的“能量加工厂” 转换，为细胞进行各种生命活动提供能量。 转换，为细胞进行各种生命活动提供能量。 纳斯绿活染法进行显微镜观察线粒体的形态。 纳斯绿活染法进行显微镜观察线粒体的形态。 实验学时3个。 实验学时3个。 一、实验目的 初步掌握用差速离心法分离大鼠肝细胞线粒体的方 初步掌握用差速离心法分离大鼠肝细胞线粒体的方 法。 法。 学习并掌握高速离心机和匀浆器的使用方法。 学习并掌握高速离心机和匀浆器的使用方法。 二、实验原理 线粒体(mitochondria)是真核细胞中产生能量的重要细胞器。细胞中的 线粒体(mitochondria)是真核细胞中产生能量的重要细胞器。细胞中的 能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联 能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联 磷酸化生成ATP ，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研 磷酸化生成ATP ，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研 究通常是在离体的线粒体上进行的。 究通常是在离体的线粒体上进行的。 制备线粒体时，可将组织匀浆液悬浮在悬浮介质中进行差速离心法进 制备线粒体时，可将组织匀浆液悬浮在悬浮介质中进行差速离心法进 行分离。在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），大小不一的 行分离。在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），大小不一的 颗粒沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一个均匀 颗粒沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一个均匀 悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由 悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由 于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离 于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离 二、实验原理 心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降 心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降 在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞 在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞 核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分 核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分 离。 离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散 相，在—定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 相，在—定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操 作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。 三、实验用品 1. 材料 1. 材料 昆明种小白鼠 若干只 昆明种小白鼠 若干只 2. 器材 2. 器材 冷冻高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、 冷冻高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、 目尼龙网（通常为铜筛）、玻璃匀浆器、PH计、高压灭 目尼龙网（通常为铜筛）、玻璃匀浆器、PH计、高压灭 菌锅等。 菌锅等。 3. 试剂 3. 试剂 ① 0.9%灭菌的生理盐水。 ① 0.9%灭菌的生理盐水。 ② 1%詹纳斯绿B染液，用0.9%灭菌的生理盐水配制。 ② 1%詹纳斯绿B染液，用0.9%灭菌的生理盐水配制。 ③ 0.25mol/L蔗糖十0.01mo1 ／L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4) ： ③ 0.25mol/L蔗糖十0.01mo1 ／L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4) ： ④ 0.34mol/L蔗糖十0.01mol/L tris-盐酸缓冲液(pH7.4) ④ 0.34mol/L蔗糖十0.01mol/L tris-盐酸缓冲液(pH7.4)