dna重组技术与基本2.ppt

第二章 DNA重组技术与基本操作 §2·1 DNA的结构与功能 §2·2 限制性内切酶（Restriction Endonuclease, RE） §2·3 克隆载体（cloning vector） §2·3·1 质粒载体（Plasmid vector） §2·3·2 ?-噬菌体载体（?-phage vector） §2·3·3 柯斯质粒（cosmid ） §2·3·4 丝状噬菌体载体——M13 §2·3·5 酵母人工染色体（YAC） §2·4 原核细胞的转化与筛选 §2·4·2 转化 §2·4·3 筛选 §2·5 原核生物基因组文库的构建与筛选 §2·6 获得真核生物目的基因的方法 §2·6·1 cDNA法 §2·6·2 化学合成DNA §2·6·3 PCR法获得目的基因 注：klenow 片段 —— 是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 N 端的大片段 功能： 5`? 3` DNA 聚合酶的活性 —— 使 DNA 链在模板的指导下延伸 3`? 5` 的核酸外切酶活性 —— 识别并切除错配的碱基，保证 DNA 复制的准确性 在分子克隆中的用途： 修复由 RE 造成的3`凹端，使之成为平末端 合成标记探针 催化 cDNA 第二条链的合成 双脱氧法测序 ② 生物素标记法 具体的方法与同位素标记法类似，只是把 32P 换成生物素（biotin） 检测方法：加入链霉抗生物素蛋白－碱性磷酸酶复合蛋白，与探针上的生物素充分反应后，洗净未反应的，再加入无色底物（5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸（ BCIP ）和硝基蓝四氮唑（ NBT ），反应生成蓝色产物 筛选步骤： 将文库克隆涂布至母盘上培养成一个个小克隆 转移到尼龙膜上 加入蛋白酶等水解酶 裂解细胞，使DNA裸露出来 加热至 94℃ DNA变性，同时使 DNA 紧紧地结合到膜上 加入探针，并降温至 55℃ 复性，与探针杂交 二、改造成载体 M13 基因组有 6.5 kb，其上的所有基因都是噬菌体增殖所必需的，不能删除任何片段，只能通过定点诱变或在合适位点插入一段 DNA 片段 的方法对其改造 包括： 定点诱变封闭重复的重要限制性内切酶切口 引入合适的选择性标记，将 MCS 插入LacZ`基因内 在 MCS 两侧区域改为统一的 DNA 测序引物序列 三、优点 ? M13 噬菌体在包装时不受体积限制，因此其容载能力大，可达野生型噬菌体 DNA 的 6～7 倍，即插入片段可达 40kb ? 可直接产生为 ＋ssDNA，可用于 DNA 测序、DNA诱变和制备特定的 DNA 探针 ? 单链和双链均能转染宿主，可根据人工加上的标记进行筛选 四、缺点 ? 较大的外源片段插入后，在扩增过程中容易丢失 —— 克隆的片段越大，发生丢失的概率就越大； ? 单链载体分子感染的细胞中，往往是单双链混杂，分离双链较麻烦 一、酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosome, YAC）的基本构成： ? 着丝粒（centromere, CEN）— 保证姊妹染色体在有丝分裂时被正确地分配到各子细胞 ? 端粒（telomere , TEL）— 位于染色体末端，可防止染色体被核酸酶切割掉 ? 自主复制序列（automatic replication sequence , ARS）— 即真核生物染色体的复制起始点 ? 筛选标记 — 酵母的一些必需的合成酶基因，如ura 3、trp 1，或显色的筛选标记 sup 4 注 ? MCS — 插在某个酵母的筛选标记中，如sup 4 ? 原核生物的 ori 和抗性基因 — 载体质粒可以在大肠杆菌中扩增与制备 注： 酵母的必需的合成酶基因（例如 leu 2）—— 作为酵母的筛选标记，其受体细胞是该基因缺陷型的（leu 2 - ），受体在不含某种物质（Leu）的培养基中无法存活 显色基因 —— 如 sup 4，受体细胞是 ade2 基因赭石突变菌株，那么sup 4 基因的表达使菌落呈白色，而 sup 4 被破坏不表达