tan第三章基因工程的载体.ppt

欢迎同学们听课！ 欢迎研究生听课！ 本课程内容 第一章 绪论 第二章 基因克隆的工具酶 第三章 基因工程的载体 第四章 目的基因的制备 第五章 目的基因导入和重组子的筛选 第六章 外源基因的表达 第七章 基因操作的基本技术 第八章 植物基因工程及应用 第九章 动物基因工程及应用 第十章 医学基因工程及应用 第三章 基因工程的载体 3.1 载体的功能及其特征 3.2 质粒克隆载体 3.3 病毒（噬菌体）克隆载体 3.4 酵母载体 3.5 人工染色体克隆载体 3.1 载体的功能及其特征 载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 载体：指能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。 载体的功能: 1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件 作为工程载体必备的条件 具有多个单一的限制性内切酶酶切位点 有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 具有筛选转化子的选择性标记基因 安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中。 分子量小，拷贝数多。 携带外源基因的幅度宽 自主复制型载体和附加载体的扩增方式 载体的类型 应用范围：克隆载体、表达载体。 应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植物和动物）、穿梭载体。 构建来源：质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体、质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体。 克隆载体(cloning vector) 用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建。 表达载体(expression vector) 使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载的目的基因能够复制、转录和翻译。 穿梭载体(shuttle vector) 又称双功能载体(bifunctional vector)。能在两种不同的生物体内复制的载体。 同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列(ARS)，它即能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。 主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效率。 病毒载体(virus vector) 常用的动物病毒表达载体可分为两大类： 整合型（integrated）载体: 即外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是 SV40－PSV系列和逆转录病毒－逆转录病毒表达载体pLPGHL、pMSV 等。 游离型(transient)或称病毒颗粒型载体: 这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗粒的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒 载体从构建来源分 质粒载体 病毒或噬菌体载体 质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体 质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体 3.2 质粒克隆载体 3.2.1 质粒的生物学特性 3.2.1.1 质粒DNA的复制 3.2.1.2 质粒DNA的不亲和性或互不相容性 3.2.1.3 质粒的转移和迁移性 3.2.1.4 质粒的重组性 3.2.1.5 显性质粒和隐性质粒 3.2.2 质粒载体的构建 3.2.2.1 理想的质粒载体应具备的条件 3.2.2.2 构建质粒载体应遵循的原则 3.2.2.3 常见质粒载体及其构建 3.2.2.4 质粒载体的评价 质粒（plasmid） 指独立存在于宿主细胞染色体外、能够自我复制的DNA分子。 广泛存在于细菌细胞中，在某些蓝藻、真菌和绿藻细胞中也发现；在酵母、眼虫、衣藻等真核生物中也存在。 绝大多数为环状双链DNA分子；极少数为线性质粒和RNA质粒。 环状双链质粒DNA的三种构型： 超螺旋(SC)/共价闭合环形(cccDNA, covalently closed circular DNA)；开环(oc-DNA, open circular DNA)；线性(L-DNA, linear DNA) 3.2.1 质粒的生物学特性 （一）自主复制性　　质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。