病毒RNA提取手册.doc

法则：QIAamp病毒RNA试剂盒在扩增技术中提供最快捷和简便的方式来纯化病毒RNA，纯化病毒RNA可以使用非肝素抗凝的血浆，血清和其他无细胞体液。样本可以新鲜或冻融不超过一次（多次冻融可导致病毒载量下降并应该避免该种情况）。样本反复冻融会有冷沉淀物的聚集，当使用真空管时会导致QIAamp滤膜的堵塞。 QIAamp病毒RNA试剂盒一般可用于从许多病毒中分离出单个病毒RNA，但不能保证每种病毒均适用。程序：QIAamp病毒RNA试剂将硅胶膜的选择结合特性和微旋转或真空技术的速度连接起来，理想地适用于多样本的同时处理。样本首先溶解于高浓度变性液，来确保RNA酶失活并且完整的病毒RNA分离。然后调整缓冲液来提供RNA与膜结合的最适条件，如此样本装载到旋转柱中。RNA结合在膜上，污染物通过使用两种不同的清洗液，两步实现特异性洗脱。高质量RNA通过特异性无RNA酶的缓冲液洗脱下来，可直接使用或安全储存起来。洗涤过的RNA不含蛋白，核酸酶和其他污染物或抑制剂。特异性的QIAamp膜能确保在20分钟内高度回收纯净而完整的RNA，不需要使用苯酚或氯仿萃取，也不需要酒精沉淀。所有的缓冲液或试剂都不含RNA酶。重点：第一次准备RNA请参考附录 该试剂盒所有步骤均应在室温下快速完成。 收集并离心样本后，血浆或血清可存放于2-8℃中6小时，长期储存应在-20至-80℃冻融别超过一次。反复冻融可导致蛋白的失活和凝集，使病毒滴度降低并随后导致病毒RNA产量的降低。另外，冻融形成的冷凝集可堵塞滤膜，如果冷凝集可见，可简单通过6800g离心3分钟来浓缩分离，离心后在不搅动片状沉淀物同时移走上清液。 避免细胞中DNA的干扰：1.推荐使用无细胞体液 2.对含有细胞的样本（包括脑脊液、骨髓、尿液和试子），首先应过滤或者是1500g离心十分钟，留取上清液 3.若RNA和DNA已经并联分离，洗出液可通过不含RNA酶的DNA酶来消化处理，随后高温处理（70℃15分钟）来使DNA酶失活 该试剂盒能分离超过200个碱基的RNA分子，小的RNA分子在该条件下无法定量。手册：纯化病毒RNA（spin） 开始前准备工作：室温平衡样本 室温平衡AVE缓冲液 检查AW1和AW2两种缓冲液是否准备妥当 添加carrierRNA—AVE缓冲液到AVL缓冲液 附表：试剂准备 1.添加310ul AVE缓冲液到包含310ug冷冻干燥的carrierRNA的管中，形成 1ug/ ul 的溶液。彻底溶解carrierRNA，分成适宜等分，-20℃保存。冻融次数不要超过3次。 检查AVL中的沉淀，如有必要80℃孵育到沉淀溶解。计算需要的缓冲体系的体积。操作步骤：Carrier RNA 加入310ul AVEAW1:加入125ml无水乙醇AW2:加入160ml无水乙醇按说明书比例配 AVL+( Carrier RNA-- AVE )560ul (AVL+ Carrier RNA-- AVE )+140ul 血浆样品于EP管中，震荡15s室温孵育10分钟，充分裂解加入560ul无水乙醇，震荡15s取630ul 上述液体注入带有滤柱的管内放入离心机离心，6000g，一分钟弃掉套管内液体，再将剩余630ul 注入离心，6000g，一分钟弃掉套管换新套管，柱内加入500ul AW1离心，6000g，一分钟弃掉套管换新套管，柱内加入500ul AW220000g，离心三分钟弃掉套管换EP管, 6000g，一分钟空离换EP管柱内隐膜上方加入60ul AVE,需加入滤柱中间，孵育5分钟6000g，离心一分钟，RNA样品于-70℃保存