实时荧光定量PCR技术：定量分析功能与软件应用.pdfVIP

CT 标准差小于0.5时候表示技术重复性好 实时荧光定量PCR 技术：定量分析功能及软件应用 定量PCR 除可以对样品的初始浓度进行准确定量外，还有其它多种丰富的应用。还包括基 因表达调控情况的分析、等位基因的分析等，那么这些功能是如何在一台定量PCR 仪上实 现的呢？下面将进行一一介绍。 利用标准曲线对样品的初始浓度进行定量： 用已知浓度的标准品绘制标准曲线来对未知样品定量，首先要有一组稳定的标准品。标准品 可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR 产物， 当然也可以是基因组DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必需保证稳 定。一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准 确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。 以Rotor-Gene3000的操作为例，以标准曲线对未知样品定量是默认的分析方法。软件可在 反应尚在进行时就对结果进行分析，结果随着反应的进行可实时更新，当然也可以等反应完 全结束后再进行分析。 点示“Analysis” ，弹出分析框，默认分析功能即为“Quantitation” ，点击“Show” ，软件即自 动给出包括标准曲线 （包括R 值，R 平方值，扩增效率、标准曲线公式等）、标准化的荧光 曲线、各样品计算浓度 （包括标准偏差、变异系数等）在内的结果。 若是使用SYBR Green I 法，还可进行熔解曲线分析，以判断退火温度是否合适，产物中是 否有引物二聚体的影响。对于SYBR Green I 的客户，我们建议一定要在最后做一步熔解曲 线的分析，这对于反应条件的优化和结果的正确判定都有着非常重要的作用。 同样，点击“Analysis” ，在分析窗口中选择“Melt”，点击“Show” ，自动给出分析结果。 完成了所需的分析之后，如还需给出分析结果报告，点击“Analysis”边上的“Report”选项， 选择报告模板，软件自动给出报告。 利用定量技术进行基因型分析研究： 常用的分析方法有两种，一种是Taqman 探针法，一种为FRET 探针法 （又称Hyb 探针）， 运用以上两种方法进行基因型的分析需要一台有多通道的荧光定量PCR 仪。Taqman 探针 分析基因型是以扩增信号的有无来判定，而FRET 探针则根据扩增后片段熔解温度的不同 来判定。 以下为用Taqman 探针判断基因型的实例： 这里，突变型的探针以FAM 荧光素标记，野生型的探针以VIC 荧光素标记，检测时分别同 时检测了FAM 通道和VIC 通道的荧光情况。这里，3、4号样品只在FAM 通道有信号，而 在VIC 通道里无信号，表明这两个样品为突变型；1、2号样品在FAM 通道无信号，在VIC 通道有信号，表明这两个样品为野生型；而5、6号样品在两个通道都有信号，但荧光强度 恰为其它样品的一半，说明这两个样品为杂合型。 并且，我们可以在软件里将不同的通道定义为不同的基因型，软件会根据不同样品在各个通 道的荧光情况，自动对各个样品的基因型做出判定。 以下为用FRET 方法分析基因型的实例： 如上图，荧光探针与突变型完全匹配，而与野生型存在一个碱基的错配，因而打开这两组双 链所需的能量就不同，具体体现在熔解温度的差异上，因而突变型的样本有较高的熔解温度， 而野生型的样品熔解温度相对较低。在图中，5号样本熔解温度较低，为野生型