大鼠细小病毒双重PCR检测方法的建立.pdf

32 实验动物与比较医学 LaboratoryAnimalandComparativeMedicine doi：10．3969j／．issn．1674—5817．2017．01．007 大鼠细小病毒双重PCR检测方法的建立 饶 丹，朱余军，伍妙梨，袁文，王 静，尹雪琴，丛 锋，练月晓， 黄碧洪，徐凤娇，刘向楠，刘助红，黄 韧，张 钰，郭鹏举 (广东省实验动物监测所，广州510663) 摘【要】 目的 建立快速检测大鼠细小病毒的PCR方法。方法 根据大鼠细小病毒基因序列的特 点，建立鉴别检测大鼠细小病毒(RPV)与其他三种大鼠细小病毒(H．1、KRV、RMV)~5双重PCR方 法。根据RPV核酸序列的性质，在 2基因筛选了一对用于特异扩增RPV株的引物，在NS1基 因设计了一对用于特异性扩增H．1、KRV和RMV的引物 结果 两对引物组成的二重PCR方法 可以特异性的扩增RPV而不扩增核酸同源性高的小鼠细小病毒和多种其他病原微生物；敏感性实 验表明，二重PCR的最低检测限可达 1000拷贝／ 。双重PCR结合测序在检测23份临床样本 中，检测出7份RMV阳性，包括 1份与RPV共感染阳性样本。结论 本研究建立的检测RPV的 双重PCR方法具有特异性好、灵敏度高及操作简单等优点，是一种简便、可靠的检测方法。 [关键词]大鼠细小病毒(RPV)；H一1；KRV；RMV；双重PCR 【中图分类号】$855．3Q95—33 [文献标识码】A [文章编号]1674．5817(2017)01．0032．04 大 鼠细小病毒是一类广泛存在于大鼠群 中的病 染 鼠可通过粪便长期 向外排毒 ，污染饲料 、饮水 毒 ，属于细小病毒科 ，细小病毒属 ，为一类无包 和周围环境 ，细小病毒在 鼠群中持续存在对动物实 膜 的小DNA病毒。H一1(Toolanvirus—1)株和 KRV 验研究结果造成干扰甚至严重影响 。 (KilhamRatVirus)株是 1950年代末期因感染大鼠中 由于RPV株与其他3种大鼠细小病毒株及其他 传代的肿瘤细胞系而被发现，后续又在 自然感染大 啮齿动物细小病毒核酸同源性差异大…1，建立一种 鼠中发现了RPV(ratparvovirus)株和RMV(ratminute 检测四种大鼠细小病毒株而不检测其他啮齿动物细 virus)株 ¨l。通常情况下，自然感染细小病毒的成 小病毒株的单重 PCR方法 比较困难 ，这也给一次 年大鼠无临床体征表现：临床观察到只有少数几例 性筛查大 鼠细小病毒株带来不便 。 KRV 自然感染的情况但还未发现H．1株 自然感染的 本文建立 了检测 4种大 鼠细小病毒株的双重 病例f3]。自然感染KRV株的大 鼠可出现胎儿被母体 PCR方法，并经特异性、敏感性及临床样 品检测 。 吸收和胎儿小脑发育不全、乳鼠黄疸及幼 鼠脱水等 症状。H．1、RMV和RPV株感染大 鼠后临床症状 1 材料与方法 不明显，但也可在 鼠群 中造成持续性感染。在野 生大鼠中大 鼠细小病毒有较高的感染率较高，被感 1．1 试剂 核酸提取试剂盒为DNA／RNA共抽提试剂盒(天 [收稿 日期]2016．09．05 根)，PCR反应酶试剂、pMD．19T载体等试剂为 [基金项 目]广东省科技计划项 目(2O14B07O706)【(】6)；国家科 TAKARA相关产品(大连宝生物)。 技支撑计；~lJ(2015BA107B00)广东省科技计划项 目 1．2 样本的收集 (2013B0604O00281 大 鼠细小毒株 H一1，KRV来 自于ATCC，RMV、 [作者简介]