刘焰201212本免疫学实验.pptVIP

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刘焰201212本免疫学实验

②双向免疫扩散 [原理] 将可溶性Ag和Ab分别加到琼脂板上相应的小孔中,使两者各自向四周扩散,若Ag与Ab相对应,两者相遇即发生特异性结合,并在比例适合处形成白色沉淀线。每一对应Ag和Ab可出现一条沉淀线,根据沉淀线的有无、位置、形状以及对比关系,可分析Ag或Ab成分。 ③对流免疫电泳 [原理] 对流免疫电泳是双向琼脂扩散与电泳技术的结合。Ag或Ab分子在一定的pH溶液中带有电荷,在电场作用下可发生定向移动。将Ag、Ab分别加在pH为8.6缓冲液琼脂中电泳,因各种血清蛋白质都带负电荷,泳向阳极。由于电渗作用,液体则流向阴极,二者方向相反。Ab(多为丙种球蛋白)的等电点较高(pH 6~7),故带负电荷少,所以电泳力小于电渗力,向阴极移动。而Ag的等电点较低(pH 4~5),所带负电荷多,故其电泳力大于电渗力,向正极移动。如Ag、Ab相应,相遇,在比例适当时即形成白色沉淀线。 由于电场限制了Ag、Ab分子的自由扩散,因而提高了试验的敏感性(提高10~20倍),并缩短了反应时间(与双向琼脂扩散相比)。 ④火箭电泳 [原理] 火箭电泳是单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测Ag的技术。在含已知Ab琼脂中打孔,再加入待测Ag,通电后Ag定向地通过含有Ab的琼脂,相应的AG和Ab在比例合适处形成沉淀峰(图1)。沉淀峰的高度与Ag浓度呈正比。该法可定量检测Ag。 [方法] ⑤免疫电泳 [原理] 免疫电泳是电泳和双向免疫扩散相结合的一种Ag方法。 先将待测Ag加入琼脂板小孔中进行电泳,因电泳速度不同可将待测Ag中的不同组分分开,然后再与横槽中已知Ab进行双向扩散,每一对相应的AgAb结合形成一条沉淀弧(图9-1)。根据弧的数目、形状和位置,可分析样品中的Ag原成分及性质。 [方法] ? ? ?2 ?1 Alb (三)补体参与反应 (四)免疫标记技术(免疫荧光法、酶免疫测定、放射免疫测定、化学发光免疫法、免疫印迹法、免疫PCR) 二、免疫细胞检测: (一)淋巴细胞分离及类型鉴定 (二)T细胞功能测定 (三)B细胞功能测定 (四)吞噬细胞功能测定? (一)淋巴细胞分离及类型鉴定 葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法、 黏附法、尼龙毛吸附法 E花环试验、 磁珠分离法、淘选法、 流式细胞术、 抗原肽- MHC分子四聚体技术 E花环试验 [原理] 人类T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体(CD2分子),简称E受体。故T淋巴细胞体外能直接与绵羊红细胞(SRBC)结合,形成E花环。 (二)T细胞功能测定 T细胞增殖试验 细胞毒试验:51Cr释放法、LDH释放法、 凋亡细胞检查法 细胞因子检测 皮肤试验 ? 淋巴细胞增殖试验(淋转试验) [原理] T淋巴细胞在体外培养时,当受到丝裂原(如PHA、ConA)或特异性抗原刺激时,可以发生增殖。检测方法有形态学计数法、 3H-TdR掺入法和MTT比色法。 TC 丝裂原 静止T 淋巴细胞 淋巴母细胞 (三)B细胞功能测定 (B细胞增殖试验、抗体形成细胞测定) (四)吞噬细胞功能测定(趋化功能测定、 吞噬功能测定) ? 小鼠巨噬细胞吞噬功能试验(体外法) [原理] 巨噬细胞具有吞噬异物的功能,将巨噬细胞与被吞噬物(鸡红细胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等)共同温育,染色,在光学显微镜下计数吞噬异物的巨噬细胞的吞噬率,以此判断巨噬细胞的吞噬功能,从而评价机体的免疫状态。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * 思考题 为什么标记一种二抗能检测多对抗原抗体系统? 免疫荧光技术 是利用荧光素标记的抗体来分析或定位相应抗原,以测定细胞相应抗原的存在。广泛应用于免疫学中的一种荧光素是异硫氰酸荧光素(FITC),当在荧光显微镜下用紫外光照射时, 其发出可见的黄绿色荧光。另一个广泛应用的荧光素是藻红蛋白(PE),其发红色荧光。 免疫荧光技术主要包括直接法和间接法。 实验四 间接免疫荧光实验 免疫荧光技术-直接法 免疫荧光技术-间接法 实验四 间接免疫荧光实验 [原理] 间接免疫荧光法是用荧光素标记二抗以检测A

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