分子生物学研究方法xg.ppt

B 外源基因——分离基因 目的基因的分离及载体 （一） 目的基因的获取 DNA libraries DNA libraries are sets of DNA clones, each of which has been derived from the insertion of a different fragment into a vector followed by propagation in the host. A clone is a genetically distinct individual or set of identical individuals Genomic DNA libraries CDNA libraries Genomic libraries prepared form random fragments of genomic DNA, which may be inefficient to find a gene because of the huge abundance of the non-coding DNA cDNA libraries DNA copies (cDNA) synthesized from the mRNA by reverse transcription are inserted into a vector to form a cDNA library. Much more efficient in identifying a gene, but do not contain DNA coding for functional RNA or noncoding sequence. 第二链合成方法 PCR： 反转录酶或ＤＮＡ聚合酶Ｉ合成： 接头： 双脱氧法测序：就是使用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸序列的方法。 试剂：DNA模板（单链或双链）；一种适当的DNA合成引物；DNA聚合酶； dNTP； ddNTP 基本原理：DNA聚合酶以被测DNA链为模板，准确合成出互补链，在合成时，某种dNTP换成了ddNTP， ddNTP作底物，使之掺入到寡核苷酸链的3’末端，导致3’末端无3‘-OH，DNA链的生长终止，产生在不同的专一位置终止的长度不同的互补链。 检测方法：通过掺入放射性核苷酸和测序胶（聚丙烯酰胺凝胶）电泳，即可读出模板DNA的互补链序列。 DNA重组过程： 重组DNA 质粒DNA 基因片段 1972年,P.Berg: 构建第一个DNA重组分子 1997年,动物克隆: 克隆羊多莉诞生 1977年，基因工程产品的出现 H.W.Boyer,第一个基因工程产品(SS) 1973年,S.S.Cohen:第一个基因克隆实验 2001年，人类基因组计划 人体生长激素释放激素(SS) 抑制和调节多种激素的作用 从动物脑中提取: 5mg50万只羊脑 基因工程 9升大肠杆菌 培养液 基因重组技术应用 大肠杆菌 SS蛋白 重组体 + SS基因 目的基因 基因载体 外源基因在宿主细胞中的表达 重组子 目的基因的mRNA 表达蛋白质 大肠杆菌（ E.coli）受体细胞 表 1 E.coli表达体系 优势： 一种成熟的基因克隆表达的受体细胞 繁殖迅速，培养代谢易于控制 易于进行遗传操作和高效表达 不足之处： 1）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。 2）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特异性空间结构。 3）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。 2目的基因在E.coli中的高效表达 三个因素： 强化蛋白质的生物合成 抑制蛋白质的降解 恢复蛋白质的空间构象 3目的基因表达产物的检测 1）蛋白质的PAGE 对照 样品 Marker 2）表达蛋白生物学功能检测 淀粉酶基因表达 4目的蛋白的分离纯化 分子筛 亲和柱 离子交换 抗原抗体 目的蛋白 基因载体 目的基因 质粒 噬菌体 病毒 PCR cDNA 人工合成 基因文库 限制性内切酶 有切口的载体 有切口的目的基因 DNA连接酶 重组体 转化 转染 体外包装 带重组体的宿主细胞 表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法 目的基因的表达 目的基因 基因载体 重组体 分 切 接 转 筛 表 总体技术路线 5.3 RNA基本操作技术 5.3.1 总RNA的提取 RNA易遭降解，实验要求较严格。总RNA提取的方法有多种，主要有LiCl法、CTAB法、异硫氰酸胍法（TriZol）。 异硫氰酸胍法（TriZol）原理： TRIZOL试剂中的主要成