肿瘤细胞培养课件.pptx

　 肿瘤细胞培养 　;;优点： ①可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化和生物因素对肿瘤细胞生命活动的影响。 ②既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变的发生机理。 ③可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。 ④可用于快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。 ⑤研究周期短，比较经济。 缺点： 长期培养可使细胞生物学特性发生改变；体外实验所得的结果不能完全代表体内的情况，应与体内试验结合研究更为合理等。;;1．形态和性状 (1)形态不规则，细胞界限清晰，核大，核仁数目多，核膜和核仁轮廓清楚。 (2)折光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而细密，微丝走行不规则，与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。;2.培养特征 (1)生长方向性消失，失去接触抑制，数量增多时可呈多层重叠生长。 (2)失去锚着依赖性（停泊依赖性），可在琼脂、甲基纤维素等支撑物上生长。 ;NIH3T3细胞经癌基因转化后出现转化灶（100×）;2.培养特征 (3)营养要求不高，在无血清或低血清（ 2%~5% ）条件下仍能生长，成为检测细胞恶变的一个指标。 。 (4)能自分泌促增殖因子，软琼脂培养单个细胞能形成集落。 ;3．永生性 (1)永生性（immortality）也称不死性，体外培养表现为可无限传代而不死亡，体外培养的肿瘤细胞系、株都具有这种特性。 (2)体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性（包括侵润性）是两种性状，受不同基因调控。 (3)多数恶性肿瘤在体外培养时并不那么容易成功，永生性是在体外培养后获得的。 永生性不等于恶性，某些细胞如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等具有永生性而无恶性。 ;4．致瘤性 细胞接种同种动物或裸鼠后的致瘤性是客观反映细胞恶性程度的指标。 ;5．浸润性 浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，体外培养的肿瘤细胞仍保持有这种特性，当与正常组织混合培养时，能侵润入其他正常组织中，甚至能穿透人工隔膜。;6．异质性 通过肿瘤细胞培养及克隆分析发现，同一肿瘤是由具有不同生物学特征的细胞亚群构成的。这些细胞亚群的浸润性、生长率、转移能力、核型、对激素的反应、对抗癌药物的敏感性均不同，这种特性被称为肿瘤细胞的异质性（heterogeneity）。 同一肿瘤内的细胞活力有差别，其中有的衰老、退化，有的处于周期阻滞状态，只有处于活跃增殖的肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的成分。;7．细胞遗传性 体外培养的肿瘤细胞失去了二倍体核型，呈异倍体或多倍体生长。;;;;;;实体瘤取材方法： 取术后或活检切取的标本立即浸入无血清培养液并及时进行培养。尽可能去除溃疡及坏死组织，避免污染，对取自外露的肿瘤组织，应在培养前在含两性霉素B 、青霉素、链霉素的培养液中浸泡10～20分钟，再用洗液反复冲洗干净后，再作培养。 体腔液取材方法： 在无菌条件下采取体腔液(胸水或腹水)，不需加抗凝剂，可直接离心收集细胞，不要久置，也不要在冰中冷却，而应尽早接种。 血液(骨髓)取材法 白血病患者可取血液或骨髓，主要以取外周血为研究对象，用肝素抗凝的注射器无菌抽取5～10mL外周血，置于试管中立刻分离培养。 标本于4度放置不宜超过24h。; 人癌细胞建系必须要有完整的记录，包括组织来源、病人姓名、住院号、年龄、性别、临床诊断、病理诊断（应明确分类分期）、术前放化疗情况，为细胞建系的重要材料。 为了鉴定建立的细胞系来源和生物学特性，最好留有病人正常组织和血标本。;肿瘤细胞的分离培养 肿瘤细胞对培养基要求不如正常细胞严格，一般常用RPMI1640，DMEM、Mc-Coy-5A等培养基，血清浓度不高，10%即可，建议在原代培养时最好能加入生长因子或原患者血清(1%～2%)以利细胞生长，培养方法很多，主要有组织块法、酶消化法、钽网法、脱落细胞法等。原代细胞的培养方法如下：;;;;;;成纤维细胞的去除 在原代培养中，常在培养物中混有正常成纤维细胞，若把正常细胞误认为是癌细胞，就会使整个工作失去意义，若不及时去除这些成纤维细胞，由于它比肿瘤细胞生长快，最终能抑制肿瘤细胞的生长。 尽早排除成纤维细胞，是肿瘤细胞长期培养建系的关键。常用方法包括：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法、密度梯度离心法。;;;;;; 肿瘤细胞原代培养注意事项;在传代肿瘤细胞培养应注意的问题;;制作方法： 1.培养细胞 首先在2４孔培养板内分别接种相同数量的细胞。计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记为0 h。 2.计数细胞密度 从接种时间算起，每隔24h计数３孔内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数2～3次。如此操作至第七天结束。 3.绘制曲线 以培养时间为横坐标