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马兜铃酸体内检测方法及代谢转化研究 项目完成单位：国家药物及代谢产物分析研究中心 项目完成人： 李亚伟 摘要建立了简单、灵敏的高效液相色谱法（HPLC）测定大鼠血浆中马兜铃酸I浓度的方法。马兜铃酸I和内标吲哚美辛经乙酸乙酯液-液萃取后，用HPLC法进行分析。色谱柱为YMC C18柱（5μm, 3.0mm×150mm I.D.）；流动相为乙腈-水-冰醋酸（50:50:1）；流速0.3mL·min-1, 检测波长254nm。药代动力学研究表明大鼠口服马兜铃酸I后吸收很快，消除较慢，药-时曲线消除相存在有多峰现象，按非房室模型计算药代动力学参数。并且在血浆中发现了一个可能的马兜铃酸I代谢产物。我们采用正、负离子化模式的ESI-MS、APCI-MS等多种质谱分析方法对马兜铃酸I及其代谢物进行了探索研究，但是由于马兜铃酸I离子化困难，离子化效率低，未得到理想的结果。然后我们通过往流动相中加入醋酸铵以及改变多种流动相体系等措施使马兜铃酸的离子化效率有所改善，从而分析研究了马兜铃酸的[M+NH4]+离子在LC-MS/MS谱上的裂解方式，并检测到可能是马兜铃内酰胺Ia的硫酸结合型II相代谢产物。但是本质谱分析方法还有待于进一步的改进。 研究背景 近年来，欧洲学者报道了一系列含有马兜铃酸（Aristolochic acid, AA）的中草药导致肾损伤的病例，并将此称为“中草药肾病”。目前，这一发现已经引起国内外学者的广泛关注，从而开始对AA所致肾损伤的临床表现及病理机制进行深入的研究。 AA是马兜铃属植物中的主要成分，该属植物分布广泛，在我国有40多种，其中有些是常用中药，如马兜铃、关木通、广防己、青木香、天仙藤、寻骨风等。在一些减肥中药中，由于使用了含有AA的马兜铃属植物，特别是误将关木通、广防己用作为有利尿作用的木通，从而造成使用者肾脏功能损害，其临床表现是贫血和高血压，肾功能呈“亚急性”或“快速进展性”的不可逆损伤，停药后仍不能逆转，往往在数月或1～2年内发展为终末期肾病，严重者可致肾功能衰竭。医生建议在使用一些含有AA的中草药时应特别慎重，严防肾损伤的发生。 目前有关AA引起肾损伤的机制尚不十分清楚，它在人体内的吸收、分布、代谢及消除过程也未被充分阐明[3]。因此，研究AA的体内检测方法，了解其体内过程及药代动力学特点，将有助于深入研究其毒理机制，从而为其毒副作用的防治提供理论依据。另一方面，若能对患者体内的AA水平进行有效而准确的监测，则有可能对毒副反应的发生起到预警作用，最大限度地避免悲剧的重演。因此，AA的体内检测方法及代谢研究具有十分重要的理论和实际价值。 近二十年来，除了有少量植物中AA的HPLC分析研究外，国内外有关AA体内分析方法的文献报道几乎没有。其药物动力学研究系采用紫外分光光度法，显然无论灵敏度和特异性均不能符合要求；而代谢产物的研究则是从生物样品中分离制备代谢物纯品，这样往往可能遗漏含量较低的代谢物。因此我们拟采用HPLC、LC-MS、GC-MS等技术，研究建立AA在生物样品中新的分析方法，使其具有灵敏度高、特异性好的优点，并符合药物动力学研究和临床药物监测的需要，为全面研究AA的毒理机制、控制毒副反应的发生提供方法学基础，从而为中药现代化、科学化进程作出贡献。 二、马兜铃酸体内检测方法及代谢转化研究策略 建立了简单、灵敏的高效液相色谱法（HPLC）测定大鼠血浆中马兜铃酸I浓度的方法。以SD种雄性大鼠作为研究对象，研究了大鼠单次口服马兜铃酸I溶液后其药代动力学行为。另外采用正、负离子化模式的ESI-MS、APCI-MS等多种质谱分析方法对马兜铃酸I及其代谢物进行了探索研究。具体实验设计如下： 1、以SD种雄性大鼠作为研究对象，体重210±20g。 2、配制马兜铃酸I（1.00 g?L-1）和内标物吲哚美辛（1.00 g?L-1）的标准储备液。 3、药代动力学实验部分所使用的液相条件：色谱柱为YMC C18柱（5μm, 3.0mm×150mm I.D.）；流动相为乙腈-水-冰醋酸（50:50:1）；流速0.3mL·min-1, 检测波长254nm。 4、对血浆中的马兜铃酸I和内标吲哚美辛使用重蒸乙酸乙酯进行液-液萃取。 5、对分析方法按有关规范要求进行了平均方法回收率、精密度与准确度和稳定性的考察。 6、研究了大鼠单次口服马兜铃酸I溶液后其药代动力学行为。 7、以苯巴比妥钠诱导大鼠，制备大鼠肝微粒体。 8、对马兜铃酸I进行大鼠体外肝微粒体温孵体系中的代谢进行研究。用HPLC法对大鼠体外代谢产物进行分析。 9、生物样品收集：大鼠（n=4）在给药前均禁食12小时，以含5%蔗糖的生理盐水维持，同时收集空白尿和粪。给药后收集0-24小时及24-72小时尿和粪。大鼠（n=4）禁食12小时后，做胆汁引流手术，观察3小时，同