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统和生物工艺产乙醇研究进展摘要：随着生物技术越来越多的介入到燃料乙醇的生产中，统和生物工艺(consolidated bioprocessing)—CBP，因其可将纤维酶生产、纤维素水解和酒精发酵融合于一步工艺中完成，且大大降低生产成本，使其受到学术界的广泛关注。为使联合生物工艺成为可能，常用以下两种策略：一种是天然纤维降解微生物改造途径, 将天然存在的可降解纤维素的微生物，以使其适应CBP 生产的要求；另一种是重组策略，通过基因重组的方式将不能降解纤维的微生物获得降解纤维素的能力，并且生产的产品性质符合CBP的要求。利用这两种策略使得统和生物工艺成为可能。关键词：统和生物工艺；纤维素；乙醇；目前全球面临着能源短缺和环境污染的严峻挑战，而生物乙醇作为一种可再生的清洁能源，具备资源丰富、燃烧性能好、储备运输方便等优点，近年来备受关注。当前的乙醇生产方式主要以淀粉或糖类为原料，因其消耗大量粮食资源并占用耕地面积，存在很大的局限性。木质纤维素是地球上最丰富的有机物质，而以木质纤维素为原料的燃料乙醇，作为可以缓解能源危机、减轻环境污染的可再生绿色能源，已经引起了世界各国的高度重视，是具有巨大市场前景的新能源产业。但高昂的成本却阻碍了这些新技术的推广。为此，人们进行了大量的研究，简化工艺，降低成本。其中将纤维素转化过程中的四个中间转化过程：纤维素酶和半纤维素酶的生产；将预处理后的碳水化合物聚合酶水解成单糖；六碳糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖等）的发酵；五碳糖（木糖和阿拉伯糖等）的发酵。该生产工艺过程繁琐，生产周期长，而且增加投资成本。CBP 相对于其它一体化程度较低的工艺过程，因其不包括生产纤维素酶产品的步骤，底物和原料的消耗相对较低，所以生产成本低，效率高。虽然CBP 工艺可以大幅的降低纤维酶的生产成本，但是它对所用的微生物却有较高的要求。所用的微生物必须比传统的纤维发酵微生物具有更好的底物利用度和较好的产品构型。因此需要对微生物进行改造。这些改造可以从两个方面进行：一种是天然策略，利用自然界存在的纤维降解微生物，用代谢工程提高其产品的产率和性质；另一种是重组策略，是改造不能分解纤维素的微生物，向其植入纤维酶系统，以使其能分解利用纤维素，并表现出较高的产率。以下我们将对这两种途径分别进行介绍。一、天然策略将天然存在的可降解纤维素的微生物，尤其是厌氧微生物进行改造，以使其适应CBP 生产的要求。这些研究的主要目的是提高纤维降解微生物代谢产物的产率，以适应工业化生产的需要。目前对于天然纤维素分解性策略研究较多的是溶纤维素梭状芽孢杆菌( Clostridium cellulolytium) 和热纤维梭状芽孢杆菌( Clostridium thermocellum) 等高温厌氧纤维素分解细菌［1］。高温纤维素分解细菌不仅可以降解纤维素、半纤维素等复杂的碳水化合物产生戊糖和己糖，还可将降解产物转化为乙醇。另外，高温纤维素分解细菌具有对pH、温度、环境的适应能力强等适合于工业菌种的特性。利用高温纤维素分解菌进行乙醇发酵不仅可以提高生物催化反应速度和乙醇转化效率、避免乳酸菌等杂菌的污染，而且高温条件还有利于乙醇的回收。Shaw 等［2］又构建了高温厌氧菌T．saccharolyticum乙酸激酶(ack) 和磷酸乙酰转移酶( pta) 基因的自杀质粒pSGD9，利用该自杀质粒和质粒pSGD8 研究者成功敲除T．saccharolyticum的乳酸脱氢酶、磷酸乙酰转移酶和乙酸激酶的基因，从而切断了乳酸和乙酸的生成，得到了双基因敲除突变株ALK2( ldh－和ack /pta－) 、单基因敲除突变株ldh－和ack /pta－等3种工程改造菌。分批发酵结果显示，菌株ALK2 对葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖的利用率均超过92%，最终乙醇浓度可高达37 g /L，且无其他副产物的产生。2009 年Cripps 等［3］利用基因敲除技术改变热葡糖苷酶地芽孢杆菌GeobacillusthermoglucosidasiusNCIMB11955 和G．thermoglucosidasiusDL33的代谢途径，使碳代谢途径的混合酸代谢流转向乙醇，从而达到了提高乙醇产量的目的。结果显示，重组菌株的乳酸产量明显减少，乙醇产量得到了一定的提高，但在突变菌中仍然检测到丙酮酸的积累。该研究团队还成功敲除丙酮酸甲酸裂解酶( pflB) 基因、上调表达丙酮酸脱氢酶基因( pdh) 并得到了突变株TM242 ( ldh－，pdhup，pfl－) 。该菌株具有葡萄糖代谢速率快、丙酮酸积累少等特性，并且乙醇产率高达0. 42 g /g;利用纤维二糖时的乙醇产率达0. 47 g /g，是理论最大产率的92%。二、重组策略通过基因工程的方法，人工构建既能分解木质纤维素又能发酵戊糖和己糖产生乙醇