牛卵母细胞电激活参数的研究.PDFVIP

维普资讯 7；7易 第 25卷 第 3期 西北农业大学学报 Va]．25Na．3 l997年6月 ActaUnlv．Agrlc．Boreal~-accldentaHs Jun．1997 牛卵母细胞电激活参数的研究 张美佳 西北农业大学发育生物学研究室，陕西扬陵 71~100) 摘 要 分析丁影响牛体外成熟卵母细胞电激活的主要参数，初步建立了电激活的实验 程序．结果表明，卵母细胞激活率随着卵由孥的延长、电场强度的增加l以及电脉冲次数的增多而 升高，含Ca抖、Mg抖离子的电澈液显著高于非电解质液。以03mol／L甘露醇+l00~mo|／L CaCIz+100amol／LMgC1为电澈藏，施加1．6kV／cm、160 s，3次电脉冲间隔15min，激活 率、卵裂率、囊胚发育率分别为86．0 ，86．5 及489 ． 关键词 鎏亟耋，圭|!!：必 兰 竺咝 中围分类号 兰 ， 休止于第二次减数分裂中期(M I)的卵母细胞可以通过多种物理化学因素，如温度、 电刺激、渗透压、酶 ，钙离子载体 A 等激活 “。其 中电激活是影响哺乳动物胚胎细胞核 移植成功率的关键技术环节。前人曾报道了电压、脉冲持续时间及不同液体对小鼠卵母细 胞电活化效果的影响 “；Collas等研究了场强、卵龄、脉冲次数和电场形状对小鼠卵母细 胞电活化的影响 “；国内也有关于卵龄、场强、脉冲宽度及脉冲次数对小鼠和家兔卵母细 胞电激活及孤雌发育影响的报道 目前，有关牛卵母细胞电激活的报道较少。本研究拟 对影响牛体外成熟卵母细胞电刺激孤雌激活诸因素于以研究，为牛核移植成功率的提高 提供详实的实验依据。 1 材料与方法 1．1 材料 从西安屠宰场取回牛卵巢，吸取直径为2～6mm 卵泡卵母细胞并进行常规的体外成 熟培养 “]。成熟培养液采用含体积份数为lO 发情牛血清 (OCS)和25mmol／LHEPES的 TCM-199培养液(GIBCO)，激活卵体外培养液为体积分数lO 犊牛血清 (NCS)的TCM一 199液，透明质酸酶 (SIGMA)。CE一450型电融合仪 (由中科院发育生物学研究所制造)；电 刺激室(自制)，由两块0．4mDI×2．0mnix30．0mm的铜片牯于载玻片上构成，间距为0． 5mm；c0培养箱为 日本产。激活液采用含或不含100~．mol／LCaCI2+100~mol／LMgC| 的0．3mol／L甘露醇液。细胞松驰素B(CB，SIGMA)。 1．2 方法 卵母细胞处理 将培养2O，22，24和26h的卵母细胞，分别以含2g／L透明质酸酶的 TCM一199液处理5～7rain，结合微玻管吹吸的机械作用，去除卵丘细胞，观察成熟情况。 并将成熟的卵母细H自随机分为两组用于电激活试验。 收稿 日期 1996—1O-2 课题来源 饼陵科技开发基金资肋项 日 作者简介 王新庄，男 1963年生 助理研究员一理士 维普资讯 74 西北农业大学学报 第25卷 电刺激处理 将成熟卵母细胞置于两 电极之间的电激活液中，平衡2min，以不同条 件的电脉冲进行电激活，多次脉冲试验组，脉冲间隔为15min．电刺激后的卵母细胞放入 培养液中，盖上石蜡油，体积分数5 CO：、饱和湿度、38．5℃进行微滴培养。 活化鞋查 培养8h后，用光学显微镜(倒置)检查卵母细胞活化情况。只有出现1原 核l极体(1PN，1PB)，1原核2极体(1PN，2PB)，2原核l极体 (2PN，1PB)或卵裂的卵母细胞 判断为激活。进而统计体外发育的卵裂率及囊胚发育率。 统计分析，试验结果用 ￡检验进行差异显著性检验 。 2 结 果