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表 观 遗 传 学 第二章 DNA甲基化 Epigenetic differences：monozygotic twins 内容纲要 一、DNA的甲基化 二、真核生物的DNA甲基转移酶 三、DNA去甲基化 四、DNA甲基转移酶抑制剂 一、DNA甲基化(1) 1. DNA甲基化：在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMTs) 的作用下，将一个甲基添加的胞嘧啶的5’-碳分子上，形成5-甲基化胞嘧啶(5-methylcytosine) 2.胞嘧啶甲基化后产生5-甲基化胞嘧啶能够自发的脱氨基形成胸腺嘧啶(Thymine)：5mC - T 3. 哺乳动物中，~1%的DNA碱基能够发生甲基化修饰 4. DNA甲基化的分布： (1)转座子 (2) 逆转录病毒衍生的重复序列 (3) 大多数功能基因的编码区 一、DNA甲基化(2) 1. DNA甲基化的模式： (1) 线虫：无甲基化的胞嘧啶 (2) 果蝇：极少量的甲基化胞嘧啶，识别模式CpT (主要) vs. CpG (极少) (3) 哺乳动物：CpG (~70%)或者CpNpG 2. CpG– Cytosine phosphate Guanine 3. 镶嵌的甲基化(mosaic methylation): 基因组中，高度甲基化的部分DNA序列被大的非甲基化DNA序列所分隔开 4. 难以被DNA修复系统所识别： CG→TG是可遗传的 CpG岛的甲基化(1) 1. CpG岛：富含CpG区域，长度500~1000bp，GC含量超过55% 2. 非随机出现：~60%的编码基因的5’UTR区域（转录起始区域）含有CpG岛。 3. CpG的含量： CG出现的期望值（百分比）：1/16 = 6.25% 观察值：很少（~1%） 原因：CG具有很高的突变率 4. C-T转换率是其他碱基对转换率的10-40倍以上 5. 例如：人类肿瘤细胞中的p53基因，50%的点突变都发生在CpG上。 CpG岛的甲基化(2) 1. CpG在重复片段以及基因的3’UTR区域能够发生甲基化 2. CpG岛通常不被甲基化 3. 哺乳动物中：26,000-45,000 CpG岛。常分布在持家基因和一些组织表达特异性基因的启动子区域 4. CpG岛：可以被HpaII酶(C|CGG)切成小片段，因此也叫HTF岛 C–– 5mC –– T? Deamination 去氨基化反应 DNA甲基化的检测 A．基因组甲基化水平(Methylation Content)的分析 高效液相色谱 高效毛细管电泳法 B．候选基因(Candidate Gene)甲基化分析 甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法 重亚硫酸盐测序法 甲基化特异性的PCR 甲基化荧光法(MethyLight) 焦磷酸测序 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法 ???? ?? C. 基因组范围的DNA甲基化模式与甲基化谱分析 限制性标记基因组扫描 甲基化间区位点扩增 甲基化CpG岛扩增 差异甲基化杂交 由连接子介导PCR出的HpaII小片断富集分析 甲基化DNA免疫沉淀法 高效液相色谱 HPLC是一种比较传统的方法，是根据DNA或蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。由于在动态相和静态相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。随着系统的压强的增加，其分辨率增高。故而能够定量测定基因组整体水平DNA甲基化水平。该方法由Kuo等1980 年首次报道。过程是将DNA样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5 mC/(5mC+5C)的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。这是一种检测DNA甲基化水平的标准方法。 高效毛细管电泳法 这是一种利用窄孔熔融石英毛细管来从复合物中分离不同化学组分的技术。其基础是在强电场下不同分子的由于其所带电荷，大小，结构以及疏水性等不同而相互分开。用HPCE方法处理DNA水解产物来确定5mC水平，简便，经济且敏感性高。 重亚硫酸盐测序法 该方法首先用重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变，PCR扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后,对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化。此方法是精确度很高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序,过程较为繁琐、昂贵。 Bisulfite Modification 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfiterestriction analysis, COBRA)???? ??? 这种方法对标本D