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时间分辨荧光技术 广州市源起生物科技有限公司 主要内容 时间分辨荧光免疫技术（TRF）定义。 TRF的标记物及特点。 为什么叫“时间分辨”? TRF在免疫分析方法学中的地位。 各种免疫方法学的比较。 临床应用 回顾标记免疫学发展 放射免疫 （精度：10-12mol/L ） 酶联免疫 （精度：10-9 mol/L ） 胶体金标记 （金标：10-15mol/L ） 化学发光 （精度：10-15mol/L ） 电化学发光 （精度：10-17mol/L ） 时间分辨荧光（精度：10-18mol/L ） 生物芯片 时间分辨荧光技术  （Time-Resolved Fluorescence） 时间分辨荧光免疫分析 （TRFIA） 时间分辨免疫荧光分析（TRIFMA） 时间分辨荧光核酸探针分析 时间分辨荧光细胞活性分析 时间分辨荧光探针分析 时间分辨荧光技术原理 （TRF） 用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质； 当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点 （特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长），用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。 根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。 时间分辨荧光免疫原理图 时间分辨荧光免疫试剂工作原理示意图 标记物为具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素 镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种： 铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Te) 镧系元素荧光特点： 荧光寿命极长 镧系元素螯合物（60~900 us) 铕：714us 普通荧光免疫中荧光团：1~100us 样本中蛋白质荧光：1~10us，易猝灭。 Stokes位移大（大约290nm） 铕：发射光613nm、激发光340nm， 荧光素的Stokes位移为28nm 荧光特异性强。（发射光谱带很窄：615± 5nm） 解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍 利用镧系元素光谱特点，将发射荧光与激发荧光分辨开来，零本底的又一保障 DELFIA技术为临床检测带来的先进性 灵敏度更高，检测范围更广 以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书 试剂 DELFIA Immulite ACS-180 AFP 0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml CEA 0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/ml HCG 0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L TSH 0.005-100μU/ml 0.002-75μU/ml 0.03-150μU/ml FSH 0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/ml Prog 0.08-120nmol/L 无 0.1-40ng/ml Prolactin 0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml 　 标准曲线稳定，试剂保质期时间长 放射性免疫分析法（RIA） 应用 放免自60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。 夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。 缺点 放射性（125 I），对环境的污染及对身体的危害，该方法已经为重视环保的国家逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室） 125 I 的半衰期短而导致其试剂有效期短。 标记物125 I 的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。 操作繁琐，出报告时间长。 无法保存备用。 酶免疫分析法（ELISA ） 应用 酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害。 试剂有效期较长。 衍生技术： 荧光酶免疫分析 增强化学发光酶免疫技术 曾经一度被认为是取代放免的检测手段。 缺点 灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。 因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性不好。 化学发光免疫分析法（CLIA） 应 用 单个样本检测速度快，适合做急诊。 灵敏度较高。 自动化程度高。 分类： 以丫啶酯直接标记—ACS180系统 以HRP标记，鲁米诺为发光底物—Amerlite系统 以AP为标记物，AMPPD为发光底物—I