北京协和医院中心实验室实验指南激光扫描共聚焦显微镜操作.PDFVIP

北京协和医院中心实验室实验指南 激光扫描共聚焦显微镜操作流程 秦伟 2013-12-28 目的及应用： 激光扫描共聚焦显微镜 （Laser Scanning Confocal Microscope ，LSCM ）用于原位鉴 定和观察细胞或组织内生物大分子、细胞及亚细胞形态结构、蛋白质 （如受体、抗 原、抗体、酶、细胞骨架蛋白等基因表达产物）、DNA 、RNA 、细胞膜流动性 （荧光光漂白恢复技术）、细胞内氧自由基活性、细胞内钙离子浓度变化、膜电位、 活体细胞或组织功能的实时动态监测。 激光扫描共聚焦显微镜可以：（1）光切片扫描、3D 图像处理、时间序列拍摄成像； （2 ）细胞、绿荧光蛋白、生物荧光样品观察分析；（3 ）荧光原位杂交分析。 试剂及设备： 荧光探针；Leica TCS SP5X 全光谱式白光激光扫描共聚焦显微镜。 北京协和医院中心实验室实验指南 超连续光纤和激光源，可选择任意激发波长范围自470 到670 nm 下工作。适合给 任何样品，任何染料最多可同时使用8 条激发线。直观软件LAS AF 提供完全的自 由度和灵活性来选择对染料所需的优化的激发光波长。所有Leica SP5 广泛功能如 光谱探测和AOBS 等, 都包括在Leica TCS SP5X 内。 实验步骤： 根据实验要求制备样品完毕后。即可进行观察。步骤如下： 一、开机 1. 依次打开电脑桌右侧 “PC Microscope” 、“Scanner Power”及“Laser Power”三个 圆形按钮，然后将 “Laser Power”按钮右侧的激光开关钥匙（Laser Emission ）顺时 针旋转90 度至“On-1”位置。记录开机时间。 2. 打开显微镜电源及荧光电源，记录荧光灯使用时间。 3. 双击电脑显示屏桌面上的“LAS AF” 图标启动徕卡共聚焦软件。 4. 点击 “OK” 以打开软件。系统自检完毕后，显示LAS AF 基本界面。 二、在显微镜下观察样品 1. 选择合适的物镜， 2. 将样品置于载物台上，在明场条件下选择合适的视野。 三、采集共聚焦图像 1. 选择所需激光。 2. 进行光路设置。设置激光及其输出功率、分光镜、检测波长范围、PMT gain 及 offset 。 3. 透射光检测器的选择。显示透射光检测器(PMT Trans) 。 4. 选择观察方法BF 、DIC 等。 5. 选择扫描模式。 6. 预览图像，优化参数。 7. 采集共聚焦激光扫描图像。 北京协和医院中心实验室实验指南 8. 保存共聚焦图像。 9. 使用空白光盘刻录 注意事项： 1. 使用人需提前7 天预约。 2. 请保持样本表面干燥、洁净，否则管理员有权拒绝用户使用显微镜。 3. 如需使用20X 以上（包括20X ）镜头，样本与镜头之间只能间隔0.17mm 的玻片。 4. 仪器周围要远离电磁辐射源。 5. 环境无震动，无强烈的空气扰动。 6. 控制工作温度在21 ℃（波动范围：+1 、-1℃）。 7. 请用户自带光盘 （CD 或者DVD ），刻录数据只能使用光驱刻录机；严禁使用 移动设备 （例如U 盘、移动硬盘等）。