第十四章临床遗传学.pptVIP

植入前诊断 （preimplantation diagnosis）是利用微操作技术和DNA扩增技术对胚泡植入前进行检测。 思考题 1.遗传性代谢病的诊断应从哪几方面着手？以PKU为例说明。 2.可以通过哪些方法进行产前诊断？ 人群中不同个体基因的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。 DNA顺序上发生变化而出现或丢失某一限制性内切酶位点，使酶切产生的片段长度和数量发生变化称为RFLP。 基因内大片段的缺失、插入及基因重排也可引起限制性内切酶图谱的变化，使限制性酶切片段的大小和数量发生变化。 1.限制性片段长度多态性（RFLP） HbS 镰型细胞贫血 正常人 Mst II 异常 Southern 1.35kb 1.15kb 0.2kb ?A?A ?A?S ?S?S 0.2kb 1.15kb 1.35kb RFLP 法检测成年型多囊病APKD AD， 1/1000，30岁后，肾、肝多发性囊肿：腰痛、蛋白尿、血尿、高血压、肾盂肾炎、肾结石等，导致肾功能衰竭和尿毒症。 APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKD Gene与α珠蛋白基因3’端附近的一段小卫星DNA序列（3’HVR）紧密连锁，因此，可以通过RFLP连锁分析进行诊断。 1 2 1 2 3 4 5 5.7kb 3.4kb 2.3kb 2.PCR（聚合酶链反应）及相关技术 聚合酶链反应技术检测 PCR的一般过程 预变性(92-95?C,2-5m) 变性(92-95?C,30s) (25-35) 复性 (40-60?C,30s) 延伸(72?C,30-60s) 总延伸(72?C,7m) 经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。 1）PCR/ASO探针斑点杂交： 1986年，胡流清等基于点突变原理，用寡核苷酸探针进行基因诊断。 正常探针 突变探针 PKU，AR 等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASO ） 探针通常为长20bp左右的核苷酸 正常探针、突变探针 PCR/ASO技术: 即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。 HbS 正常探针 G A G 异常探针 T A G 正常人 患者 DNA DNA 正常人 患者 DNA DNA 2）聚合酶链反应-单链构象多态法 聚合酶链反应-单链构象多态(PCR-SSCP) DNA分子在电泳中的行为取决于分子量和分子构象，DNA单链的构象取决于序列。 PCR产物变性后于中性胶中电泳，有一个碱基的不同，则会形成不同的二级结构，造成迁移率不同。与正常对照比较，若电泳行为异常，则认为内含突变的碱基。 PCR-SSCP 1989年，Orita等建立的PCR产物单链DNA凝胶电泳技术。 1 2 3 4 5 a b 1：正常人 2,4,5：纯合体患者 3：杂合体(2的弟弟) 左为泳动变位模式：a 正常人；b 纯合体患者 GAA→GAG TGT→TAT CTC→CAC PCR-SSCP 3）甲型血友病诊断（PCR—RFLP） 甲型血友病的基因诊断：已知甲型血友病XR，获得家系成员基因组DNA 。 PCR 142 bp 142bp 99 bp 43bp 电泳 结果分析 BcLI p1 p2 142bp 99bp 43bp Bcl I Bcl I - Bcl I + 142bp 99bp 1 2 1 2 3 Ⅰ Ⅱ III 1 结果分析 1）先症者II 1具有99bp片段而发病，该片段来自母亲。 2）II2有142bp/99bp，为杂合子。142bp来自父亲，为正常片段，99bp片段是来自母亲而成为携带者。 3）Ⅲ1为99bp片段 如果是 男性 为患者（99bp片段来自母亲）；女性为携带者（来自父母双方） 4）PCR产物变性梯度凝胶电泳（DGGE） 条件：尿素甲酰胺浓度梯度，恒温水浴（＞30℃） 过程：DNA逐渐由低强度进入高强度，解离温度较低 的DNA片段先达到其解离强度（变性梯度）解离 成局部单链，泳动减慢，通过溴化乙啶或银染观 测区带的变化。 3.DNA测序： 4.DNA芯片 Western 印迹技术 检测特定蛋白质 例：