实验四 溶菌酶的提取和系列性质的测定.docxVIP

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实验四 溶菌酶的提取和系列性质的测定

作业库-分享作品这是一个知识十倍速增长的年代, 参见: Did You Know?你还能忍受一遍遍重复造轮子吗?加入我们分享作业吧~ 放弃隔阂,开放共享,让我们站在巨人的肩膀上成长!该文档使用CC创作共享协议 - 署名-非商业使用授权:[/licenses/by-nc/2.5/cn/ ]实验四溶菌酶的提取和系列性质的测定实验目的:1、了解酶的基本研究过程。2、掌握溶菌酶提取和性质测定中的实验方法。3、熟悉有关生化技术的基本原理和基本操作。I.溶菌酶的提取一、实验原理在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用,才能得到较为满意的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活,为能获得尽可能高的产率和纯度,在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等,这样才能收到较好的分离提纯效果。溶菌酶(Ec.7),又称胞壁质酶、N—乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G;是一种具有抗菌作用的粘多糖酶。溶菌酶分子量约为14.4KD,是一种强碱性蛋白质,等电点在10.0以上,并对温度和酸不敏感。在自然界中,溶菌酶普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中,哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等的细胞中,植物卷心菜、萝卜、木瓜等,以蛋清中含量最丰富,鸡蛋中约含0.3%。本实验用鸡蛋为原料,通过阳离子交换层析,硫酸盐沉淀,分子筛层析等步骤提取溶菌酶。溶菌酶在应用过程中的优点:(1)溶菌酶是很稳定的蛋白质,有较强的抗热性。蛋清溶菌酶是C型,是已知的最耐热的酶;(2)溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失活,当转移到水溶液中时,溶菌酶的活力可全部恢复;(3)溶菌酶可被冷冻或干燥处理,且活力稳定;(4)溶菌酶适宜pH5.3~6.4,可用于低酸性食品防腐;(5)溶菌酶生产成本较低;(6)溶菌酶为安全高效的广谱抗菌剂,抗菌活性稳定,特别是对一些耐药性菌株有良好的抑菌作用;(7)溶菌酶是采用生物工程技术进行克隆、提取而制取,它是一种天然酶,安全绿色的食品添加剂,无抗药性。离子交换层析法:利用固定相偶联的离子交换基团和流动相解离的离子化合物之间发生可逆的离子交换反应而进行分离的方法。离子交换层析介质是在一种高分子的不溶性固体(载体)上引入具有活性的离子交换基团,即阳离子交换基团或阴离子交换基团,这些基团与溶液中相同电荷的基团进行交换反应。在一定的pH环境中,不同物质的解离度不同,分子或离子带电性的强弱不同,与离子交换基团的交换能力也不同。因此,物质通过离子交换层析可以得到相应的分离。盐析:盐析是蛋白质分离纯化中的常用方法。碱金属或碱土金属的中性盐类[如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl或MgSO4等] 加入蛋白质溶液中溶液后,会与蛋白质发生电荷中和现象。当盐类的浓度足够大时,蛋白质胶粒脱水而沉淀,称为盐析。由盐析所得的蛋白质沉淀,经过透析或用水稀释以减低或除去盐后,能再溶解并恢复其分子原有结构及生物活性,因此由盐析生成的沉淀是可逆性沉淀。各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需要的盐浓度也不一样。调节混合蛋白质溶液中盐的浓度,可使各种蛋白质分段沉淀。分子筛层析:分子筛层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的,分子筛层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒,凝胶颗粒的内部具有立体网状结构,形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后,各个组分就向固定相的孔穴内扩散,组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比空穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部,完全被排组在空外,只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动,它们历经的流程短,流动速度快,所以首先流出,而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部,经历的流程长,流动速度慢,所以最后流出。这样,分子量越大的组分越先流出,分子量越小的组分越后流出,这样样品经过分子筛层析后,各个组分便按分子量从大到小的顺序依次流出,从而达到了分离的目的。透析:通过小分子经过半透膜扩散到水(或缓冲液)的原理,将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。二、仪器、试剂及材料1、器材:1. 高速冷冻离心机2. 核酸、蛋白检测仪3. 恒流泵4. 收集试管2、试剂:1. 0.lmol/L 磷酸盐缓冲液, pH 7.0 2. 0. 5mol/L NaOH3. 0. 5mol/L HCl3、材料:1. Amberlite-CG-50 阳离子交换树脂2. Sephacyl S-100HR 3. 新鲜鸡蛋4. 磷酸氢二钠(Na2HPO4)5. 磷酸二氢钠(Na2HPO4)6. 氯化钠(NaCl)7. 硫酸铵 [(NH4)SO4] 8. 氢氧化钠(NaOH)9. 甘油10. 盐酸(HCl)11. 透析袋12. 层析柱(

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