脑缺血模型筛选方案昆明制药集团.docxVIP

治疗脑缺血药物筛选的模型 一、动物模型 1全脑缺血模型 四血管闭塞模型 大鼠麻醉后，分离暴露两侧颈总动脉和第一颈椎左右两个横突孔，用电凝器将两侧椎动脉电凝以阻断其血流。24 h后在大鼠清醒的情况下用动脉夹夹闭双侧颈总动脉，这样供应脑循环的4条动脉血管全部被阻断，产生双侧性脑缺血。缺血一定时间后(10-20min)，可按实验要求重新开启动脉夹进行脑再灌流。该法能够导致大脑严重缺血并有高度的可重复性，此外可通过颈动脉夹的开闭控制缺血与再灌时间，进而实现不同程度的脑缺血损伤。 沙土鼠全脑缺血模型 沙土鼠缺乏完整的Willis环，结扎双侧颈总动脉即可造成全脑缺血模型，若要观察沙土鼠缺血再灌(暂时脑缺血)，则以无创微血管夹夹闭动脉, 3h后解除夹闭，进行再灌注24h即可。此模型操作简便易行，被广泛用于对神经元细胞不可逆的迟发死亡的研究及对新的神经保护剂的筛选。 结扎大鼠双侧颈总动脉所致脑缺血再灌注模型 Wistar大鼠，体质量(293±41)g，25％乌拉坦5ml／kg腹腔麻醉，颈部正中切开分离，用小动脉夹夹闭双侧颈总动脉30min后，松开双侧小动脉夹，恢复再灌注60min，制成缺血再灌注模型。在缺血时30min经尾静脉注射受试化合物。逐层缝合伤口，术后回笼饲养，各组均腹腔注射给药5d，末次给药1h后断头处死，迅速取脑，以检测脑含水量及脑组织Ca2+，Na-K-ATP酶活性及过氧化脂质(LPO)含量。 双血管闭塞合并低血压模型 1.4.1 阻断大鼠双侧颈总动脉合并血压下降(放血或使用降压药物)，当血压下降到50 mmHg(6.7 kPa，连接6240生物信号采集系统)时，前脑血流下降到基础血流的15%以下，可引起可逆性前脑缺血。此方法操作简便，重复性好，易于控制再灌注时间。该法可使大脑皮层和海马的血流降到正常大鼠的5%~10%，用于缺血后脑代谢和组织学改变的研究。 1.4.2 取体重差异在2g以内的小鼠，乙醚麻醉背位固定，颈中切口，结扎双侧颈动脉，缝合伤口。紧接着眼眶取血7滴，观察6h小鼠的状态和死亡率。6h后取脑，测定MDA水平。 2 局灶性脑缺血模型（MCAO模型） 选用体质量（270±20）g的3月龄大鼠，用2%戊巴比妥纳ip麻醉（45mg/kg），仰卧固定于手术台上。减去颈部毛发，75%酒精棉球擦拭消毒。于颈正中切口（2cm左右），剪开浅筋膜，分离乳突泡，显露右侧胸锁乳突肌，钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌间的肌间隙，暴露右侧颈总动脉（CCA）和迷走神经。 钝性撕开颈动脉鞘，分离CCA，注意避免损伤迷走神经。分离右侧颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA），结扎ECA近心端［不必至颅底找出ICA颅外段的分支翼腭动脉（PPA），并将其分离结扎］，结扎CCA近心端，并在其分叉处打一活结备用。用动脉夹夹住ICA，在CCA分叉处剪一小口，插入预先处理好的线栓，将预制的活结稍打紧（防止线拴脱出）。松开夹住ICA的动脉夹，将线栓缓慢向ICA插入（向内上方的角度插入，否则易误入PPA），目视线栓头部进入ICA，而不是PPA（如果误入PPA，因线栓不能入颅，插入长度一般不超过10 mm则被阻）。继续将线栓缓慢向ICA入颅方向推进，插入长度约（18.5±0.5）mm(从CCA分叉处计算)，微遇阻力时停止。扎紧预制活结，以防止ICA内的线栓移动和出血，最后逐层缝合浅筋膜、皮肤（暴漏线头1cm，剪除线栓多余末端）。 分别于阻断2h、3h、4h后实行再灌注，分别鱼再灌注24h、48h、72h后处死大鼠，进行相关指标的测定。 二、细胞模型 1 缺糖缺氧后复灌诱导SH-SY5Y细胞损伤模型 1.1 自制缺氧装置 利用密封型保鲜盒（locklock普通保鲜盒HPL825）在其顶部及靠近对侧侧壁底部各穿刺一个直径0.5 cm小孔，用HYPERLINK /product/9/168199.html \t _parent \o 一次性腰椎麻醉穿刺包一次性腰椎麻醉穿刺导管螺纹接头端穿过小孔，用螺母从另一侧拧紧，周围用玻璃胶密封固定，分别用医用三通管连接，另一端连接通气用软胶管。其中连接底部三通管的胶管作为进气管，通过减压阀直接连接氮气钢瓶，由钢瓶微量调节阀进行氮气流量调节。另一端作为排气管，接一玻璃导管，插入水面下，通过气泡可以观察到气体排出情况。连接好装置后，调节干燥箱温度恒定为37 ℃，实验时将缺氧装置放入干燥箱内进行实验。 1.2 缺糖缺氧时间的考察 实验分为第1组含OGD 2 h对照组（含细胞）及空白组（不含细胞）、OGD 4 h对照组及空白组、OGD 6 h对照组及空白组（以上各组培养在单独的培养板中）。第2组含OGD 2 h组及空白组、OGD 4 h组及空白组、OGD 6 h组及空白组（以上各组培养在单独的培养板中），以1.0×105 cell