bcl2凋亡基因表达的检测原理和方法.docVIP

bcl-2凋亡基因表达的检测原理和方法 （一）原理： 细胞凋亡是一个受基因调控的主动过程，bcl-2是抑制细胞凋亡的原癌基因，正常细胞的激活和发育过程中都有表达，但在发育成熟的细胞中，其表达降低，在低分化或癌变的细胞中，bcl-2高表达与肿瘤的发生、发展相关，bcl-2过量表达常导致对化疗药物的耐药性而阻止细胞凋亡，影响治疗效果，一旦细胞发生凋亡，其bcl-2表达降低，甚至完全消失。 bcl-2家族由bcl-2、bcl-X、bax、mcl-1和A1组成。进行bcl-2基因表达的检测有两种，一种是用抗bcl-2蛋白抗体的流式细胞仪测定法，检测细胞浆中的bcl-2蛋白量，另一种是采用RT-PCR法测细胞中bcl-2 mRNA的表达。 （二）方法： 1、bcl-2蛋白表达的检测： 采用流式细胞仪和间接免疫荧光法测定细胞中bcl-2蛋白的量。 收集药物不同剂量、不同作用时间的凋亡肿瘤细胞，用含2%小牛血清的PBS洗2次。 加入2%多聚甲醛室温固定20min，再用PBS配制的Staing缓冲液洗涤。 1500r/min离心5min，弃上清，置-20存放过夜。 在冻存的细胞内加入1mlPBS配制的TB穿透液放置5min，用Staing缓冲液洗涤1次后，加2%灭活的人AB型血清1ml，37放10min。 加入bcl-2多抗工作液40ul，4孵育30min后，对照组不加多抗，随后用PBS洗3次，5min 1次。 加入FITC荧光标记的二抗工作液40ml4孵育30min后，用PBS洗3次，用流式细胞仪检测荧光强度（MFI）的变化，计算bcl-2阳性细胞表达率和bcl-2蛋白表达的平均荧光强度。 2、RT-PCR法检测细胞bcl-2 mRNA的表达： （1）总RNA提取： 为了获得高质量的真核细胞mRNA，必须使用RNA酶抑制剂。操作过程中应避免RNA酶污染器材和试剂，因此所有剥离、塑料器材先用0.1%DEPC水溶液浸泡12h，然后用无菌的新鲜蒸馏水淋洗数次，塑料器材应采用高压蒸汽灭菌。玻璃器材应于180干烤4-6h，所有溶液配制用水均用已灭菌的新鲜蒸馏水配制，所用试剂要新开封的试剂，或无菌分装至已处理的容器中，操作时应戴60Co辐照的一次性手套，并勤换，以避免环境中和操作时的RNA酶污染。提取总RNA，采用异硫氰酸胍一步提取法即可。 收集药物处理和对照组的肿瘤细胞，用PBS洗2次，冷藏5min。 加入变性液Solution D 1ml。 用4号针头抽打混匀，再加入0.1ml的3mol/L乙酸钠充分混匀，加80%饱和酚1ml，氯仿/异戊醇0.2ml，混匀后置冰上15min。 于4、12000r/min离心5min，取上清移入另一洁净的塑料离心管中，加2.5倍体积的无水乙醇于-20过夜。 次日以4、12000r/min离心30min，弃上清，用70%预冷乙醇洗2次，干燥10min，加100ulDEP 水溶解RNA，再加入300ul变性液Solution D混合，再加2.5倍乙醇，-20放2h。 用70%预冷乙醇洗2次，加 EDPC水溶解，紫外分光光度计测OD260值、OD280值。当OD260/OD280在1.8-2之间时，RNA纯度较好。 （2）RT-PCR： 合成cDNA第一链。 各组取5ugRNA进行逆转录，反应体系共20ul： a、5X逆转录缓冲液5ul； b、DTT 1ul； c、dNTP 2ul； d、Rnasin 1.5ul； e、Oligo dT 2ul f、m-MLV 逆转录酶 2ul； g、RNA样本 5ug h、DEPC水补充加至20ul。 上述组分充分混合后，现在室温作用10min，后在42反应1h，经95深深地10min，立即置冰浴冷却至4，逆转录产物即cDNA第一链于-20冻存备用。 PCR反应扩增cDNA a、P1上链，5/-GGTGCCACCTGTGGTCCACCTG-3/; b、P2下链，5/-CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG-3/. 外参照物β-actin的引物序列如下： a、P3链，5/-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3 b、P4链，5/-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3/ 扩增的产物长度分别为459bp，339bp。 以逆转录产物为模板分别与bcl-2引物，β-actin引物混合，反应体系共有50ul； a、双蒸水32.5ul； b、10 x 缓冲液5ul； c、MgCl2 5ul； d、dNTP 1ul； e、P1/P3 0.5ul； f、P2/P4 0.5ul； g、TaqDNA 多聚酶0.5ul； h、cDNA样品9逆转录产物）5ul。 扩增条件：94预变性7min，设计PCR