DNA初级损伤的检测.docVIP

DNA初级损伤的检测 一、细菌DNA修复试验 (一)原理　DNA受到损伤时，细胞内多种酶系统即参与修复过程，其中DNA聚合酶A(polA)起重要作用，如果polA缺陷，则造成修复缺陷，最终导致细胞因不能修复化学物诱发的DNA损伤而死亡。在一个试验中同时采用大肠杆菌正常株(polA+)和修复缺陷株(polA-)，用同一剂量的化学物处理，若修复缺陷株生长受抑制而正常株不受抑制，或二者有明显差别，说明受检化学物具有损伤DNA的能力。 (二)试验步骤 1.将大肠杆菌正常株W3110和修复缺陷株P3478分别接种在琼脂培养基上，在平皿中心置一直径约6mm并浸有受检物的滤纸片。 2.37℃恒温箱中培养10小时。 3.观察平皿中有无抑菌圈形成及抑菌圈的宽狭。 (三)结果评价 1.若正常株平皿中无抑菌圈而修复缺陷株平皿中出现抑菌圈，可判定阳性结果。若两种平皿中均不出现抑菌圈，判定阴性结果。 2.大多数突变致癌物用本法所得结果与用Ames试验所得结果一致，但也有一些例外，如染发剂、吖啶橙等。 3.为提高试验的灵敏度，可加入S9活化系统。有些化学物在琼脂中渗透性较差，与细菌直接接触的浓度不够，影响检测灵敏度，这种情况下可采用细菌悬液法克服之。 二、人体细胞WI-38程序外DNA合成的检测 (一)原理　细胞在正常状态下只在S期进行DNA合成，此即程序性DNA合成。如果细胞DNA受到化学物的损伤，则会动员细胞内修复系统对损伤处进行切除修复(只有少数情况为其它类型修复)，这时若在细胞培养基中加入3H-胸苷(3H-TdR)，它即可参入新修复好的DNA链中，因此种修复合成不发生在S期，故叫程序外DNA合成(UDS)。基本的过程是：令细胞贴壁生长至单层，由于接触抑制使生长完全停止，这时细胞不再合成DNA，加入DNA合成抑制剂羟基脲以确保阻断DNA合成，然后在含羟基脲的培养基中加入3H-TdR，3H-TdR不会参入DNA链。如果这时加入能引起DNA损伤的化学物，则3H-TdR能参入DNA链。一般来说，参入量与损伤程度成正比。现已证实各种射线、诱变剂和致癌物作用WI-38细胞后都有UDS发生。 (二)试验步骤 1.细胞培养：WI-38正常人体二倍体细胞株在含10%小牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的EMEM培养液中培养。 2.对照组：阴性对照以未处理的细胞为准。如果受检物不溶于培养液，可用二甲亚砜助溶再加到培养液中，其最终浓度应低于1%，并应设置溶剂对照组。如果检测体系中需加活化系统，则对照组亦应加活化系统。阳性对照物选择N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，终浓度为5～10μg/ml，不需活化系统。采用苯并[α]芘作阳性对照物，其用量为1～20μg/ml，需加入活化系统。 3.剂量选择：受检物至少应设4个剂量组，通常从5mg/ml(液体为5μl/ml)开始，采用5倍稀释法或2倍稀释法，至0.1mg/ml(或0.1μl/ml)，或更低。如果测得之UDS值低于对照值，表明加入受检物的毒性过高，这种情况下需另选4个低于毒性水平的不同浓度进行重复试验。 4.不加活化系统的检测：每个100mm培养皿中接种2.5×105个细胞，长成单层，然后将血清浓度由10%减至0.5%，培养5天以保证所有细胞进入无DNA合成状态。为防止出现DNA合成，在加受检物前半小时应向培养基加入羟基脲。每个组在加入受检物的同时加入3H-TdR，37℃保温1.5小时，倒掉培养液，用生理盐水洗涤细胞，以去净受检物和3H-TdR。刮下细胞，置于0.5%SDS(含0.017mol/L柠檬酸钠)溶液中，加入2倍体积95%乙醇以沉淀DNA，离心，用95%乙醇洗涤沉淀，重新悬浮于无水乙醇∶乙醚(2∶1，V/V)混合液中，70℃保温3分钟以溶解非聚合的杂质，离心，用95%乙醇洗涤沉淀。将沉淀溶于0.3mol/LNaOH，70℃保温20分钟以水解RNA杂质。冷却后在水浴中加入等体积的2mol/L过氯酸，离心，用0.2mol/L过氯酸洗涤1次，加入1mol/L过氯酸，加热至70℃使之溶解，离心除去不溶物，上清液用于分析DNA和放射性计数。 DNA分析：每管取样测定260nm、280nm和320nm处的光吸收值，分别计算DNA的量、纯度和浊度。放射性计数：每管取0.5ml，加入10ml闪烁液，由液闪仪测定dpm值，以dpm/μgDNA值表示UDS活性，并与对照组比较。 5.加活化系统的检测：除在加受检物之际将活化系统加入细胞培养基中外，其余操作均同上。 (三)结果评价　如果出现以下情况，可认为受检物具有UDS