RNAi在大肠癌基因治疗中的研究现状.docVIP

描述： 　　目前大肠癌(colorectal cancer)是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年增高趋势。大肠癌的发病过程是多步骤、多阶段的，受遗传和内外环境等因素的作用? 。传统治疗方法是以手术治疗为主，同时辅以化疗、放疗的治疗方案，虽然对I期和Ⅱ期大肠癌有一定疗效，但仍有大量的患者失去手术机会，而术后化疗和放疗对肿瘤非特异性，且敏感性差，副作用大，效果欠佳。因此迫切需要寻找到一条特异性高的诊断方法和有效的治疗途径。RNAi是近年来发展起来的一项新技术，是由外源或内源性的双链RNA (dsRNA)导人细胞而引起同源的mR—NA降解，进而抑制其相应的基因表达。它具有特异、高效等突出优点，现已被广泛用于大肠癌基因治疗方面的研究与探索。 ? 　　1 RNAi概述在1998年，美国学者Fire A等研究人员向线虫体内注入由正义链和反义链混合的dsRNA，出现了基因沉默现象(gene silencing)，随后Fire将这一系列特异性基因沉默现象称之为RNAi。过去十几年间学者们发现RNAi现象广泛地存在于真核细胞中。RNAi小分子也由最初的双链RNAi，发展到现今的Small interfering RNA (siRNA)、ShoahairpinRNA (shRNA)、piwi—interating RNA (piRNA)、MicroRNA (miRNA)等。RNAi的出现为医学基础研究提供了新的思路及方法，并用于某些肿瘤、病毒感染性疾病治疗的研究中。 ? 　　1．1 RNAi的作用的基本原理 RNAi的作用机制尚未明确， 目前普遍认为RNAi可分为两个阶段： ? 　　起始阶段：当病毒基因等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用该基因组进行转录产生少许dsRNA及shRNA，再经RNasem家族的Dicer核酸内切酶切割成长度为20—25bp的siRNA，siRNA被RNA解旋酶解链成正义链和反义链，其中的反义链与相关酶(包括外切酶等)结合后形成RNA沉默的复合物(RNA induced silencing com—plex，RISC)。 ? 　　效应阶段：随后携带siRNA反义链的RISC与目的基因的mRNA的互补序列特异性结合并切割结合部位两端mR—NA，断裂的mRNA随即降解，从而导致特定基因沉默。另外细胞基因组本身所产生的miRNA，经一系列酶(如Dicer酶、聚合酶等)作用后与相应的靶mRNA结合，抑制其翻译，从而抑制基因表达。 ? 　　1．2 RNAi的特点RNAi具有以下几个点特点：(1)特异性：siRNA的反义链与对应基因mRNA互补配对，碱基序列具有高度的特异性；(2)高效性：仅需少量的dsRNA以催化放大方式产生大量的siRNA，从而有效抑制靶基因的表达；(3)长度依赖性：长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21个bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割； (4)可传播性：siRNA可在RNA依赖性RNA酶(RdRP)的作用下大量扩增，并转运出细胞，在不同细胞问长距离传递和维持，使RNAi扩散到整个机体并可以传代；(5)ATP依赖性：siRNA整个作用过程中有酶参与的步骤均消耗ATP，在去除ATP的样品中RNAi现象降低或消失。 ? 　　2 RNAi在大肠癌诊疗中的研究 ? 　　2．1 RNAi在大肠癌细胞增殖的研究 大肠癌的发生过程是多步骤、多阶段的，主要与人体内抗凋亡基因的异常激活等因素有关。而抗凋亡基因的激活可导致凋亡抑制蛋白的高表达，从而抑制肿瘤细胞的增长。而RNAi可特异性的抑制某些基因的表达，所以利用RNAi封闭那些和大肠癌有关的基因从而抑制大肠癌细胞的生长，达到治疗大肠痛的目的。 ? 　　凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosisprotein，lAP)家族为一类抗凋亡基因表达产物，其中人体凋亡抑制蛋白是抑制细胞凋亡的重要成分，这一蛋白家族抑制细胞凋亡的作用在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，目前该家族已发现有Survivin、Livin等重要成员。研究表明Survivin基因是人们认识的最强凋亡抑制基因，该基因只在肿瘤组织中表达，而在正常分化的组织中几乎无表达 。Gazouli发现Survivin基因在大肠癌组织中高表达，其下游蛋白能抑制大肠癌细胞凋亡，促进大肠癌细胞的增殖。Wang等通过通过cDNA技术构建Survivin的shRNA并转导人大肠癌SW480细胞，Western blot检测细胞内Survivin蛋白的表达水平降低，检测实验组细胞生长速度减慢多停滞于G2／M期。Livin亦为IAP家族的一员，同样在大肠癌组织中高度表达，在正常组织中几乎无表达。Bo—Young等构建Livin的siRNA载体转染至大肠癌细胞，医教论文并使用R